扶金化积丸对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及机制

夏小军， 雷旭东， 段 赟， 陈浩方， 郭炳涛， 马 骏， 赵文秀， 李文基

(1.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730050)

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，全球每年大约有100万人死于该病[1]，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的85%，有70%患者表现为局部晚期或转移[2]。在过去几十年里，虽然手术、放疗、化疗等传统手段不断取得进展，但其不良反应和耐药性是降低肺癌患者生存质量和存活率的主要原因，已成为相关治疗的瓶颈[3-4]。

肿瘤负荷、侵袭、转移是肺癌治疗失败和预后不良的主要影响因素[5]，故需要开发高效、低毒、多靶点的新型药物。中医药具有来源广、成本低、不良反应少、靶点多等诸多优势，而且与传统放化疗相比在预防肿瘤复发转移方面具有优势[6]。本研究探讨扶金化积丸对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长、脏器指数、机体免疫、NF-κB、MMP-9蛋白表达的影响，以期为相关临床治疗提供参考。

1 材料

1.1 动物及瘤株 C57BL/6小鼠48只，雄性，体质量(20±2)g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0001，合格证号0000952。Lewis肺癌细胞株购自和元生物技术(上海)股份有限公司。

1.2 试剂与药物 扶金化积丸由甘肃省肿瘤医院提供，批号20190325；贞芪扶正颗粒(甘肃扶正药业科技股份有限公司，批号Z62020415)。RPMI-1640培养基(美国Thermo公司，批号AE24464298)；0.25%胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司，批号T3926890)；胎牛血清(美国Life Technologies Corporation公司，批号42G327016)；小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-2试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号1906M)；中性树胶、苏木素(北京索莱宝科技有限公司，批号G8590、G1080)；MMP-9抗体(美国Proteintech公司，批号0066523)；NF-κB抗体(美国Gene Tex公司，批号41556)。

1.3 仪器 全自动血液分析仪(上海涵飞医疗器械有限公司)；包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；电子天平(慈溪市天东衡器厂)。

2 方法

2.1 药液配制 扶金化积丸用生理盐水分别配制成质量浓度为0.087 5、0.043 7、0.021 9 g/mL的药液(即为高、中、低剂量组)，贞芪扶正颗粒用生理盐水配制成质量浓度为0.25 g/mL的药液。

2.2 建模、分组及给药 将Lewis细胞株于1640培养基(含10% FBS、1%双抗)中培养，0.25%胰酶(含EDTA、酚红)消化，调整细胞密度约为2×106/mL。40只小鼠右腋皮下接种细胞悬液0.2 mL/只建立荷瘤模型，接种约1周后待肿瘤长至0.5 cm时，将其随机分为荷瘤对照组，阳性组(贞芪扶正颗粒5 g/kg，相当于临床人用量的30倍)即扶金化积丸高、中、低剂量组(剂量分别为1.749、0.875、0.437 g/kg，分别相当于临床人用量的30、15、7.5倍)，每组8只，另取8只小鼠作为正常组，除正常组、荷瘤对照组小鼠灌胃给予等体积生理盐水外，其他各组小鼠均按0.02 mL/g剂量灌胃给予相应药物，每天1次，共14 d。停药1 h后，称定小鼠体质量，眼球采血，再脱颈椎处死，取瘤体、胸腺、脾脏待测。

2.3 小鼠瘤质量、瘤体体积、抑瘤率检测 游标卡尺测量小鼠瘤体长、短径，称定质量，计算瘤体体积、抑瘤率，公式为瘤体体积=长径×短径2、抑瘤率=[(荷瘤对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/荷瘤对照组平均瘤质量]×100%。

2.4 小鼠脏器指数检测 称定小鼠胸腺、脾脏质量，计算器官指数，公式为器官指数=(器官湿重/体质量)×100%。

2.5 小鼠血常规检测 采用全自动血液分析仪，检测小鼠血细胞计数及HGB水平。

2.6 小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平检测 采用ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平，操作严格按照相关试剂盒说明书进行。

2.7 小鼠瘤组织病理学检测 小鼠瘤组织在10%甲醛溶液中固定24 h后置于包埋盒中，流水清洗30 min，不同体积分数(由低到高)乙醇脱水，二甲苯透明瘤组织，浸蜡包埋成块，切成薄片，脱蜡水化，HE染色，中性树胶封片，在显微镜下观察。

2.8 小鼠瘤组织NF-κB、MMP-9表达检测 取小鼠瘤组织适量，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，水化，自来水冲洗，柠檬酸钠加热修复抗原，3%H2O2孵育封闭内源性过氧化物酶，PBS漂洗，一抗(1∶200)、二抗依次孵育，PBS漂洗后，DAB(1∶20)显色，当呈现棕黄色时终止显色反应，苏木素复染约1 min，不同体积分数(由低到高)乙醇脱水，中性树胶封片，在光学显微镜下拍照。采用图像分析软件，对瘤体中NF-κB、MMP-9表达进行检测。

3 结果

3.1 扶金化积丸对小鼠瘤质量、瘤体体积、抑瘤率的影响 如表1所示，扶金化积丸高、中剂量组及贞芪扶正颗粒组小鼠瘤质量、瘤体体积均小于荷瘤对照组(P<0.05，P<0.01)。

表1 扶金化积丸对小鼠瘤质量、瘤体体积、抑瘤率的影响

3.2 扶金化积丸对小鼠脏器指数的影响 如表2所示，扶金化积丸高剂量组及贞芪扶正颗粒组小鼠胸腺、脾脏指数均高于荷瘤对照组(P<0.05，P<0.01)；与扶金化积丸高剂量组比较，扶金化积丸低剂量组小鼠胸腺、脾脏指数均降低(P<0.05，P<0.01)。

表2 扶金化积丸对小鼠脏器指数的影响

3.3 扶金化积丸对小鼠血常规的影响 如表3所示，荷瘤对照组小鼠RBC、PLT、WBC数量及HGB水平均低于正常组(P<0.01)；与荷瘤对照组比较，扶金化积丸高、中剂量组及贞芪扶正颗粒组小鼠RBC、WBC、PLT数量及HGB水平均升高(P<0.05，P<0.01)，而扶金化积丸低剂量组上述指标无明显变化(P>0.05)。

3.4 扶金化积丸对小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影响 如表4所示，与荷瘤对照组比较，扶金化积丸高剂量组及贞芪扶正颗粒组小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平均升高(P<0.05，P<0.01)，扶金化积丸中剂量组IFN-γ水平升高(P<0.05)。

表3 扶金化积丸对小鼠血常规的影响

3.5 扶金化积丸对小鼠瘤组织形态的影响 如图1所示，荷瘤对照组肿瘤细胞排列紧密，形态结构稳定，核固缩罕见，偶见局灶性坏死，瘤组织血供充盈；贞芪扶正颗粒组瘤细胞呈条索状分布，出现瘤组织不同程度坏死、病理性核碎裂，瘤组织内及其周围血供较少，核固缩较多，胞浆颜色较深；扶金化积丸各剂量组随着剂量增加，坏死区域逐渐增大，低剂量组有少量出血，而高剂量组有明显坏死及出血情况，出现细胞凋亡。

3.6 扶金化积丸对小鼠瘤组织NF-κB、MMP-9表达的影响 如图2～3、表5所示，荷瘤对照组小鼠瘤组织NF-κB、MMP-9呈高表达；与荷瘤对照组比较，扶金化积丸高剂量组、贞芪扶正颗粒组小鼠瘤组织NF-κB、MMP-9表达均降低(P<0.01)，中剂量组MMP-9表达降低(P<0.05)。

表4 扶金化积丸对小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影响

图1 各组小鼠瘤组织形态(×200)Fig.1 Morphologies of mouse tumor tissues in various groups (×200)

4 讨论

中医药作为补充替代治疗的重要组成部分，由于其不良反应小、成本低、临床疗效好，常被用于肺癌的维持治疗[7]，中药复方治疗是其最重要的特点特点之一[8]。肺癌是一种与身体状态有关的全身性疾病，治疗策略强调通过多个靶点系统性调整，改善全身而产生治疗效果，而不是单纯的清除肿瘤或杀死癌细胞[9]。本研究结果显示，扶金化积丸可有效地抑制肿瘤生长，具有很好的抗癌效果。

表5 扶金化积丸对小鼠瘤组织NF-κB、MMP-9表达的影响

扶金化积丸是甘肃省肿瘤医院根据中医辨证施治理论研制出的纯中药制剂，用于肺癌的临床治疗，考虑到肺癌患者肺气不足、正气亏虚的特点，将一部分饮片提取浓缩，另一部分粉碎成细粉，以适量水为为黏合剂，制成浓缩丸。方中君药西洋参补气养阴、清热生津；臣药黄芪补气固表，岷当归补血止血，鸡血藤行血补血，生脉散(《内外伤辨惑论》[10])、百合养阴润肺、生津止咳，二至丸(《医便》[11])、山萸肉补益肝肾、滋阴止血；佐药消瘰丸(《中医方剂临床手册》[12])清热化痰、软坚散结，龙葵散瘀消肿、清热解毒，莪术、川芎活血行气止痛；使药薏苡仁渗湿健脾，山楂散瘀化积、助运脾胃，诸药合用，对因痰、瘀、毒而致气阴两虚的肺积，可共奏益气养阴、扶正祛邪之功效。

研究表明，中药主要是通过调节免疫系统发挥抗肿瘤作用[6]；本研究结果显示，扶金化积丸的抗肺癌活性可能与增强免疫器官功能、调节细胞因子的产生有关。血清细胞因子在免疫系统调节宿主防御中起着重要作用，IL-2能促进应答性T细胞的增殖，IFN-γ在抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用[13-14]。海参提取物被报道可通过上调细胞因子TNF-α、IFN-γ诱导有效的宿主保护性免疫反应[15]；本研究结果显示，扶金化积丸处理可有效上调小鼠血清细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平，增强免疫防御功能。

NF-κB是一种调节多种基因表达的转录因子，参与细胞凋亡、炎症反应、病毒复制和各种自身免疫性疾病过程等[16]，在肿瘤发生过程中可通过上调其表达来参与细胞增殖、转移、血管生成和抑制凋亡的基因促进肿瘤进程[17]。目前，用于肺癌治疗的NF-κB抑制剂正在进行临床试验，并取得良好的疗效[18]。在NSCLC中，MMP-9活性与远处转移呈正相关，此外Meta分析显示其过表达是肿瘤分期及不良预后的危险因素之一[19]。本研究结果表明，扶金化积丸可有效抑制瘤组织NF-κB和MMP-9的表达，从而发挥抗肿瘤作用，可为探讨该制剂对肺癌的潜在治疗作用提供科学依据。