酶抑制-比色法农残速测试剂盒检测蔬菜农药残留的结果分析

罗俊霞，赵建波，宋 伟，贾 冬，叶 茂，余寅曦，包 方，刘 宇，张 婧，杨亚楠，赵利敏

（1.郑州市农产品质量检测流通中心，河南郑州 450006；2.郑州市农业技术推广中心，河南郑州 450002；3.河南省农产品质量安全检测中心，河南郑州 450002；4.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州 311258 5.河南省农业对外经济合作中心，河南 郑州 450002）

0 引言

自2001年农业部以蔬菜为切入点在全国37个大中城市开始无公害农产品行动计划以来，农产品的安全问题受到人们的广泛关注，农产品检测监管成为各级农业主管部门的重要工作，植物性农产品的检测与监管以农药残留的监管为主。《中华人民共和国农产品质量安全法》和2015年修订的《中华人民共和国食品质量安全法》赋予快速检测做为检测手段的法律地位。目前，研究较多的快速检测技术有酶抑制分光光度技术[1]、分子印迹技术[2]、免疫分析技术等[3]，胆碱酯酶分光光度法检测有机磷农药和氨基甲酸酯类农药具有高效、简便、成本低等优点[1],是国内外农药残留快速检测的主流技术[4-5]，在我国农产品质量安全监管工作中一直发挥着重要作用。其中使用最为广泛的是酶抑制-比色法农残速测试剂盒，它包含酶、底物、显色剂和缓冲溶液等4种试剂，是一种非定量、非定性型的试剂盒[6]。试剂盒中的酶是决定试剂盒质量的重要因素，因为不同生物来源的酶在结构上存在一定的差异，而对有机磷和氨基甲酸酯类农药表现出不同的敏感性[1，7]，同一种生物体内存在不同的胆碱酯酶形式[8]，这些胆碱酯酶有其不同的特异性底物[8-9]，同时胆碱酯酶对有机磷农药中的硫代磷酸酯类的农药不敏感导致有机磷农药的检出率低[10]，因此不同的商品化试剂盒对不同的农药表现出不同的敏感性[11-13]；同时反应时间、反应温度及缓冲溶液的酸碱度（pH值）等都影响着酶抑制-比色法的检测结果[14-15]，薰衣草、小茴香、野生蕨类等很多植物中都含有天然的抑制胆碱酯酶活性的物质[16-20]，这些因素会直接或者间接的造成假阳性或者假阴性的检测结果，使试剂盒的检测结果和样品的真实状况发生偏差。为了了解商品化的酶抑制-比色法农残速测试剂盒的检测效果，本研究选用6个品牌市售的酶抑制-比色法快速检测试剂盒对来源于郑州市场的韭菜、上海青、山药等15个果蔬种类的53个蔬菜样本分别进行检测，同色谱、质谱的检测结果在不同的判定阈值下进行比较，得到每个品牌试剂盒的假阳性率、假阴性率和符合率，同试剂盒对农药的敏感性相结合[11-13]，旨在选取到优质的商品化酶抑制-比色法农残速测试剂盒，为农产品质量安全监管工作和实际检测工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器CL-BIII型16通道农残速测仪:（上海博纳新技术研究所、上海复博农业科技有限公司）；WH-861型漩涡混合器（上海康华仪器仪表厂）；HH.W21-Cr 420型电热恒温水浴锅（北京三二八科学仪器有限公司）；SHA-C型双重恒温水浴振荡器（杰瑞尔电器有限公司）；5 mL、200μL移液枪（美国Thermo公司）；色谱、质谱检测所使用仪器:2010型气相色谱仪（日本岛津公司,配AOC-20i自动进样器、火焰光度检测器（FPD）和DB-1701色谱柱,30 mm×0.53 mm,0.25μm）；1290-649型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；Hettic型均质机（德国Heidolph SilentCrusher M公司）；N-EVAPTM-112型氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.1.2 实验材料

（1）试剂盒:快速检测试剂盒为A（深圳）、B（广州）、C（东莞）、D（厦门）、E（湖北）、F（深圳）。

（2）农药标准品:乙酰甲胺磷、速灭磷、敌敌畏、二溴磷、敌百虫、喹硫磷、杀螟硫磷、对氧磷、甲胺磷、磷胺、辛硫磷、甲基嘧啶磷、伐灭磷、甲基毒死蜱、亚胺硫磷、谷硫磷、甲基对硫磷、除线磷、毒死蜱、嘧啶磷、倍硫磷、特丁硫磷、久效磷、地毒磷、乙基溴硫磷、治螟磷、乙硫磷、巴胺磷、吡菌磷、丙溴磷、蝇毒磷、皮蝇磷、对硫磷、甲拌磷、氧乐果、硫环磷、马拉硫磷、三唑磷、伏杀硫磷、灭菌磷、乙基谷硫磷、水胺硫磷、二嗪磷、甲基异柳磷、杀虫畏、苯硫磷、乐果、地虫磷、乙拌磷、百治磷、异丙威、速灭威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、涕灭威、仲丁威、甲萘威、灭多威、3-羟基克百威、克百威（质量浓度为1 000 mg/L，农业环境保护科研检测所）。

（3）蔬菜样品:来自郑州市场。市场检测员用A或E试剂盒检测抑制率大于50%的蔬菜样品。

1.2 试剂配制

1.2.1 试剂盒里试剂的配制各品牌的农药残留检测试剂盒里有缓冲盐、酶、显色剂和底物，使用前，缓冲盐用500 mL的蒸馏水溶解，酶、显色剂和底物分别按照各试剂盒说明书的要求进行配制（表1）。

表1 几个品牌试剂盒中试剂的配制方法和使用量表

1.2.2 标准品的配制先将1.1.2中所列标准品稀释成80μg/mL的储备液，上机时将有机磷类农药分组，稀释成0.04μg/mL的混合标准溶液，用色谱质谱对样品进行检测比对。

1.3 检测方法

1.3.1 快速检测方法将样品剪成1 cm大小的片或段，混匀后分别称取样品2 g，用6个品牌的试剂盒按照国家标准（GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测）（以下简称国标）的要求进行检测；每个样品用每个试剂盒检测3个平行，检测后读出抑制率，取其平均值。

1.3.2 色谱、质谱检测将样品打浆混匀后称取25 g样品按照行业标准（NY/T 761-2008蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定）（以下简称行标）进行前处理，之后分别用气相色谱火焰光度检测器FPD）和液相色谱-质谱联用仪进行测定，每个样品检测1次。

1.4 数据处理

将1.3.1中的速测结果和色谱质谱结果进行比较，计算出假阳性率和假阴性率，按照公式（1）、（2）进行计算。

假阳性率（%）=抑制率大于设定值的样品数/色谱、质谱60种农药未检出的样品数×100% （1）

假阴性率（%）=抑制率小于设定值的样品数/色谱、质谱60种农药检出的样品数×100% （2）

注:公式中的设定值为一定的抑制率，在表3中指10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%。

2 结果与分析

2.1 各品牌试剂盒的检测效果

由表2可知，各品牌试剂盒的检测结果同色谱、质谱的检测结果相比较，都有假阳性和假阴性的检测结果产生，按照国标[14]50%的判定阈值进行统计，出现假阳性的检测结果D＞E＞C＞A＞B=F,出现假阴性的检测结果则是A＞B=F＞C＞E＞D，同色谱、质谱检测结果的符合性:D＞B=C=F＞E＞A,最大的符合率为68%，最小的符合率为50.9%；按照行标（NY/T 448蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法）70%的判定阈值进行统计，A、C、E试剂盒检测出现的假阳性样品大于D、F试剂盒，大于B试剂盒，就假阴性样品的产生看，A＞F＞B＞C=E＞D；同色谱、质谱检测结果的符合性:B=C=D＞E＞F＞A，最大的符合率为60%,最小的符合率为34%。由此可见，酶抑制-比色法农残速测试剂盒的检测效果及其与色谱、质谱检测结果的符合性不仅与试剂盒中酶的来源有关，亦和判定阈值的大小有关。

表2 各品牌试剂盒检测效果表

2.2 各品牌试剂盒的检测效果同判定阈值的关系

2.2.1 假阳性率同判定阈值的关系由图1可知，每一种试剂盒检测样品的假阳性率都随着判定阈值的提高而降低。当判定阈值设定为抑制率10%时，F试剂盒检测的假阳性率最高，为100%，A试剂盒的假阳性率最低，为66.7%；当判定阈值设定为抑制率20%时，B试剂盒检测的假阳性率最高，为81.8%，C、D试剂盒的假阳性率最低，为63.6%；当判定阈值设定为抑制率30%时，B、F试剂盒检测的假阳性率最高，为63.6%，A试剂盒的假阳性率最低，为42.9%；当判定阈值设定为抑制率40%时，E试剂盒检测的假阳性率最高，为71.4%，B试剂盒的假阳性率最低，为18.2%；当判定阈值设定为抑制率50%时，D试剂盒检测的假阳性率最高，为54.5%，B、F试剂盒的假阳性率最低，为27.3%；当判定阈值设定为抑制率60%时，D试剂盒检测的假阳性率最高，为54.5%，B试剂盒的假阳性率最低，为9.1%；当判定阈值设定为抑制率70%时，A、C、E试剂盒检测的假阳性率最高，为27.3%，B试剂盒的假阳性率最低，为9.1%。

图1 各品牌试剂盒的假阳性率和判定阈值折线图

由图2可知，每一种试剂盒检测样品的假阴性率都随着判定阈值的提高而升高。在判定阈值设定为抑制率10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%时，假阴性率最高的都是A试剂盒，其假阴性率分别为25%、34.4%、50%、53.1%、62.5%、83.9%、87.1%；假阴性最低的均是D试剂盒，其假阴性率分别为0、0、0、7.1%、14.3%、28.6%、42.9%；当判定阈值设定为抑制率10%时，B试剂盒的假阴性率同D相同，也为0；当判定阈值设定为抑制率30%时，B试剂盒检测的假阴性率同A相同，为50%。

图2 各品牌试剂盒的假阴性率和判定阈值折线图

由图3可知，每一种试剂盒检测样品的符合率都未达到100%；但无论选择哪种判定阈值，D试剂盒的符合率均最高，在几个试剂盒中的检测效果最佳，其他试剂盒的符合率随着判定阈值的变化稍有波动。

图3 各品牌试剂盒的符合率和判定阈值折线图

A试剂盒:其符合率达到最高（58.5%）时的判定阈值设定为抑制率10%；其符合率最低（34%）时的判定阈值设定为抑制率70%；B试剂盒:其符合率达到最高（64%）的判定阈值设定为抑制率40%；其符合率最低（44%）时的判定阈值设定为抑制率30%；C试剂盒:其符合率达到最高（68%）的判定阈值设定为抑制率20%或30%；其符合率最低（56%）的判定阈值设定为抑制率40%；D试剂盒:其符合率达到最高（76%）的判定阈值设定为抑制率30%；其符合率最低（64%）的判定阈值设定为抑制率10%；E试剂盒:其符合率达到最高（61.5%）的判定阈值设定为抑制率10%或20%；其符合率最低（46.2%）的判定阈值设定为抑制率40%；F试剂盒:其符合率达到最高（60%）的判定阈值设定为抑制率20%或50%；其符合率最低（44%）的判定阈值设定为抑制率40%或70%。

3 结论与讨论

总体来看，在参与比对的6个品牌的试剂盒中D试剂盒的检测效果最佳，也就是说在所设定的7个判定阈值下，D试剂盒的检测结果同色谱、质谱的检测结果符合率最高。

酶抑制-比色法农残速测试剂盒在日常监管中广泛应用，但是由于这种试剂盒既不能定量也不能定性[6]，其测定的是一类或者两类物质的含量总和，在检测工作中假阳性、假阴性的现象普遍存在，同色谱、质谱检测结果的符合率各不相同；其符合率同判定阈值之间有一定的关系，随着判定阈值的提高假阳性率降低、假阴性率升高，但同色谱、质谱检测结果的符合性并未持续升高，每种试剂盒同色谱、质谱检测结果的符合率都是在一定判定阈值下达到最高，但6种试剂盒达到最高的判定阈值各不相同，本研究中当判定阈值设为20%时效果最好，在此阈值下，有3个品牌的试剂盒的检测效果同色谱、质谱检测结果的符合率达到最高，且在参与比对的6个试剂盒中无试剂盒在此判定阈值下出现最低的符合率。因此建议国标（GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测）、行标（NY/T 448-2001蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法）对阳性样品的判定阈值修改为20%。