大豆突变体库的低硫耐性鉴定和资源筛选

吴志医,黄也,黄方,李凯,喻德跃,王慧

(南京农业大学国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部大豆生物学与遗传育种重点实验室,江苏 南京 210095)

硫是植物生长发育和胁迫响应所必需的重要元素,是继氮、磷、钾之后的第四大营养元素[1]。植物主要从土壤溶液中吸收硫酸盐,以合成必需的有机硫化合物[2]。硫在细胞结构和生理代谢方面发挥重要的作用,缺硫影响植物的生长发育、耐逆性以及作物的产量和营养品质[3]。近年来,随着人们环保意识的提高,工业含硫废气的排放和高硫燃料的使用受到了严格管控,含硫杀虫剂、杀菌剂及除草剂用量也在不断减少;耕地复种指数提高及高产作物的大规模种植,低硫或无硫化肥的施用量持续增加,这些因素都造成土壤中的硫素被大量消耗而得不到补给,导致土壤缺硫。2018年安徽省大规模的土壤样品调查显示,缺硫耕地面积约311.19×104hm2,占安徽省耕地总面积的53.1%,个别区域缺硫严重,超过80%[4]。大豆是喜硫作物,硫在大豆结瘤、固氮以及蛋白质合成方面均有重要作用,缺硫会限制大豆叶面积增加,使叶绿素含量和硝酸还原酶活性降低,氮代谢受阻,严重影响大豆的正常生长发育和食用品质[5]。为应对土壤缺硫,筛选优异的耐低硫资源,解析耐低硫的分子机制,培育耐低硫的大豆品种,是解决这一困境的有效途径之一。

人工诱变可创造大量的遗传变异,是鉴定优异资源和分子机制研究的基础。本实验室早期利用60Co γ 射线和化学试剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)对栽培大豆‘南农86-4’和‘南农94-16’进行人工诱变,构建了一个遗传变异丰富的大豆突变体库[6-8],通过对该突变体库的鉴定,已从中筛选出多个遗传稳定的突变体,包括早花突变体elf1[8]、黄叶突变体cd1[9]、子叶折叠突变体coo[10]以及抗花叶病毒突变体[11]等。这些突变体的发现促进了相关性状功能基因的发掘和鉴定。

本研究利用室内水培试验对大豆突变体群体中的165 份材料进行不同硫水平处理,测定多个与低硫耐性相关的指标,旨在评价不同大豆突变体对低硫的耐性,并筛选稳定的耐低硫和低硫敏感突变体,为大豆硫代谢的功能基因组研究和大豆品种培育提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是由‘南农86-4’和‘南农94-16’经理化因素复合诱变产生的大豆突变体群体,共有165个突变体株系,其中以‘南农86-4’为亲本的突变体创制于2003年和2005年[6],以‘南农94-16’为亲本的突变体创制于2002年和2003年[7],该群体经过多年自交,在遗传上已经稳定。

1.2 试验设计

从每个大豆突变体材料中均挑选大小均一、表面光滑且无病斑的种子16粒,按照4×4的规格点播在装有蛭石的花盆中,播种4 d后,挑选长势一致的幼苗10株,移入对照(+S)和缺硫(-S)处理的营养液中各5株,作为生物学重复。5 d后更换营养液并去除子叶,再过5 d取样,调查性状。试验采用完全随机设计,重复3次(E1、E2、E3)。营养液配制参照陈燕宁等[12]方法,略有改动(表1)。对照为1/2霍格兰德平衡营养液,不含硫元素的1/2霍格兰德营养液作为缺硫处理,即把对照营养液中MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4分别用MgCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2代替。

表1 1/2霍格兰德营养液配方Table 1 1/2 Hoagland nutrient solution formula

由于水生环境下易染菌,为了避免苗期大豆根部受到污染,试验所用的蛭石、花盆和托盘均需提前进行高温灭菌处理。试验在南京农业大学国家大豆改良中心人工气候培养室内进行,温度为28～30 ℃,相对湿度为40%～48%,光照周期为16 h光照和8 h黑暗。

1.3 测定指标及测定方法

1.3.1 SPAD的测定用SPAD-502 PLUS叶绿素仪(柯尼卡美能达,日本)测量倒2叶(新叶)的叶绿素含量(SPADnew)、真叶(老叶)的叶绿素含量(SPADold)。重复测定3次,取平均值作为测定值。

1.3.2 株高和根长的测定株高指顶端生长点到子叶节之间的距离,根长指主根根尖到子叶节之间的距离。

1.3.3 生物量的测定以子叶节为界将植株分为地上部和地下部(根)。从子叶节处截断,用吸水纸擦掉根表面的水分,然后迅速用千分之一电子天平称量地上部鲜重和根鲜重。将鲜样装入已编号的牛皮袋中,放入105 ℃烘箱杀青0.5 h,再置于65 ℃烘干至恒重后称重,得到地上部干重、根干重。计算鲜重根冠比和干重根冠比。

1.4 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0软件进行数据统计、差异显著性分析、相关性分析以及绘图。其中差异显著性分析采用SPSS 20.0软件中的独立样本t测验(Student’st-test),相关分析采用Pearson相关系数法。

1.5 优异突变资源筛选

计算倒2叶的叶绿素含量(SPADnew)和地上部干重在-S和+S条件下的比值(-S/+S),将这2个比值定义为耐低硫参数,计算各大豆突变体株系在3个环境下耐低硫参数的平均值,据此筛选耐低硫和低硫敏感的大豆突变体。

2 结果与分析

2.1 低硫对大豆苗期性状的影响

从图1可见:突变体NJAU_M003幼苗在缺硫(-S)条件下,均出现叶片发黄、植株矮化、地上部生物量减少等症状。进一步以叶绿素含量(SPADnew、SPADold)、株高、根长、地上部鲜重和干重、根鲜重和干重为指标评价大豆突变体群体对低硫的耐性。与+S条件相比,各突变体的根长、鲜重根冠比、干重根冠比在-S条件下均极显著增加,根干重在缺硫条件下略有增加,在E3环境下显著高于对照(表2)。这些结果说明缺硫处理促进苗期大豆根生长和根部干物质量积累,从而增强根部对外界营养元素的吸收能力,适应缺硫环境。植株的叶绿素含量(SPADnew、SPADold)、株高、地上部鲜重和干重、根鲜重在-S条件下均降低(表2),在这些指标中,地上部鲜重受低硫影响最强烈,与+S条件相比,-S条件下降幅达41.94%;SPADnew次之,降幅为25.55%;株高对低硫的响应最弱,降幅为12.26%。总之,缺硫对大豆突变体地上部各性状有抑制作用,但却促进根的发育。

图1 在+S和-S条件下的大豆突变体NJAU_M003幼苗Fig.1 Seedlings of soybean mutation NJAU_M003 under +S and -S conditions+S:对照Control;-S:缺硫处理low-sulfur treatment. 下同The same below.

遗传率分析表明,在+S和-S条件下,各性状的遗传率范围分别是52.8%～88.4%、50.1%～84.8%(表2)。其中叶绿素含量在+S和-S条件下具有较高的遗传率,说明叶绿素含量这一性状受环境的影响较小,适合用作筛选极端材料的指标。

表2 突变体群体表型的描述性分析和方差分析Table 2 Descriptive analysis and variance analysis of phenotypes in mutant population

续表2 Table 2 continued

2.2 低硫改变苗期大豆各性状之间的相关性

从表3可见:大部分性状在+S和-S条件下的相关性一致,根冠比与株高、地上部生物量之间显著负相关,与根生物量之间显著正相关,其他性状之间均呈正相关关系。但不同硫水平下,一些性状之间相关性不同。在+S条件下,倒2叶的叶绿素含量(SPADnew)与地上部干重、根干重之间显著正相关,根长与地上部鲜重、根鲜重、地上部干重之间显著正相关,但在-S条件下,这些性状之间的相关性均不显著。反之,在+S条件下,根干重与干重根冠比之间无显著相关,但在-S条件下,根干重与干重根冠比之间呈显著正相关关系。另外,在+S条件下,地上部鲜重和根鲜重的相关系数为0.746,地上部干重和根干重的相关系数为0.836,这2个性状的相关性在-S条件下减弱,相关系数分别为0.610和0.764。同样,在-S条件下,地上部鲜重与鲜重根冠比之间、地上部干重与干重根冠比之间的负相关性减弱,而根鲜重与鲜重根冠比之间的正相关性增强。这些结果说明低硫对性状的影响改变了性状之间原有的相关性,特别是地上部性状和根性状之间的关系。

表3 突变体群体在+S和-S条件下各表型的相关性分析Table 3 Correlation analysis of phenotypes of mutant population under +S and -S conditions

2.3 优异突变体的筛选

从表2可见:叶绿素含量(SPADnew)遗传率最高,而在低硫条件下具有更高的地上部干重(DWS)对大豆更有意义,因此基于这2个性状计算耐低硫参数,从大豆突变体库中筛选对低硫表现为耐性和敏感的突变体。鉴于该突变体库是由2个大豆品种突变而来,其遗传背景差异较大,故在筛选极端材料时分2个亚群进行。

基于2个指标的-S/+S比值排序,共筛选出34个耐低硫大豆突变体和36个低硫敏感大豆突变体,其中来自‘南农86-4’突变群体的NJAU_M061、NJAU_M065和来自‘南农94-16’突变群体的NJAU_M099、NJAU_M115、NJAU_M128、NJAU_M134在2个指标上对低硫处理都表现为耐性;来自‘南农86-4’突变群体的NJAU_M041、NJAU_M056和来自‘南农94-16’突变群体的NJAU_M101、NJAU_M125在2个指标上对低硫处理都表现为敏感(表4)。

表4 基于叶绿素含量(SPADnew)和地上部干重(DWS)指标筛选的优异突变体资源Table 4 Excellent mutant resources screened based on chlorophyll content(SPADnew)and dry weight of shoot(DWS)

进一步对在2个性状上都表现为耐性或敏感的8个突变体以及‘南农86-4’和‘南农94-16’的表型进行分析。在这些突变体中,NJAU_M115和NJAU_M134的倒2叶的SPADnew、DWS在-S与+S条件下均无显著差异(图2-A、B),说明这2个突变体对低硫不敏感,表现出较高的耐性。突变体NJAU_M101和NJAU_M125对低硫比较敏感,在-S条件下NJAU_M101的SPADnew降幅最大,达35.5%(图2-A),NJAU_M125的地上部干重降幅最大,达55.5%(图2-B)。

图2 极端材料在+S和-S条件下的倒2叶的叶绿素含量(A)和地上部干重(B)Fig.2 SPADnew(A)and DWS(B)of extreme materials under +S and -S conditions

3 讨论

3.1 大豆低硫耐性的筛选指标

土壤硫缺乏主要发生在需硫量大的油料作物,大豆作为全球主要的油料作物同样面临着缺硫问题[13]。而大豆苗期营养生长对成熟期种子的产量及品质形成至关重要,所以筛选苗期耐低硫的种质资源对大豆育种具有十分重要的意义。大豆缺硫症状一般表现为叶片失绿,叶缘两侧呈棕色斑点、植株矮小、根瘤发育迟缓,进而导致成熟期延迟、结籽量下降[14]。本研究对大豆突变体库的165份材料进行缺硫水培处理,结果表明缺硫处理使苗期大豆幼叶黄化、薄而脆,植株矮小,生物量降低,这与前人的研究结果一致。在本研究的10个指标中,倒2叶的叶绿素含量(SPADnew)在对照和缺硫条件下均具有较高的遗传率(表2),倒2叶的缺硫症状出现较早且十分明显,因此该性状可作为一个鉴定大豆耐低硫性的一个主要筛选指标。大豆的经济价值主要是种子和地上部秸秆,对于苗期大豆来讲,地上部干重(DWS)是地上部生物量的一个重要指标,因此也可用来衡量大豆的低硫耐性。我们还发现倒2叶的SPADnew与DWS在+S条件下呈显著正相关,而在-S条件下无显著相关性,这也表明这2个性状可以作为独立的评价指标对大豆低硫耐性进行筛选。

3.2 缺硫重塑植物的株型

本研究中,苗期大豆在缺硫条件下地上部和根部的鲜重均显著下降,但根鲜重下降的幅度比地上部鲜重小;地上部干重显著下降,但根干重与对照之间并无显著差异,从而导致鲜重根冠比和干重根冠比均显著增加。在其他作物的缺硫研究也得出过相似的结论。杨慧仙对‘晋绿豆8号’‘晋豆19’和‘小红芸豆’进行缺硫处理,发现3种豆科作物的根冠比在缺硫条件下均显著增大[15]。甜菜在缺硫条件下根系与对照相比没有明显减少,主根长势减弱,但侧根量增加,根冠比增大[16]。曾秀成等[17]对2个大豆品种进行缺硫处理,结果显示这2个品种根表面积未发生显著变化,这使大豆根系在缺硫条件下维持了正常的吸收能力。这些研究说明光合产物在分配方向和强度上可能随着营养水平的改变而改变,缺硫条件下,光合产物分配到根部的比例较高,以促使根系生长,扩大与外界环境的接触面,尽可能多地获取更多的营养,从而暂时弥补缺硫给植株带来的不利影响[15]。

本研究评价了大豆突变体群体对低硫的耐性,并基于倒2叶的叶绿素含量(SPADnew)和地上部干重(DWS)筛选出稳定的6个耐低硫和4个低硫敏感的突变体,其中耐低硫突变体叶绿素含量、地上部干重在缺硫条件下,相比于对照的下降幅度要远低于低硫敏感突变体,受低硫胁迫的影响较小。