8 个杂交水稻新组合种子纯度的分子标记鉴定

蒋钰东 何茹薇 罗俊涛 杨 扬 郑 军 付 均 曾正明

（1 四川省农业科学院水稻高粱研究所/农业部西南水稻生物学与遗传育种重点实验室，德阳 618000；2 国家水稻改良中心四川泸州分中心，泸州 646100）

水稻是我国最重要的粮食作物之一，我国约有65%的人口以稻米为主食，因此保障水稻的正常生产对我国粮食安全有着重要作用。目前我国水稻常年种植面积维持在3000 万hm2，杂交水稻占我国水稻种植面积的55%左右，杂交水稻比常规水稻品种产量优势明显，一般可增产20%左右，优势品种增产幅度更大，杂交水稻的应用和推广使得我国水稻单产大幅度提高，对保障我国水稻生产具有重要贡献[1]。杂交种纯度的高低直接影响杂交水稻的种子质量，种子质量是决定水稻大田生产中产量表现的关键，也是决定种子公司生产的产品在市场上具备强大竞争力的重要因素，是种子公司安身立命之本。检验杂交种子的纯度是每个种子公司将杂交种子推向市场前的必要环节[2]。目前田间种植鉴定种子纯度是最为普遍的检验方法，主要通过在海南加代种植或正季种植期间，对水稻进行全生育进程的农艺性状观察，比对各单株间的典型性状，通过品种的农艺特征特性鉴别真实杂交种及杂株[3]。海南种植鉴定有时间相对提前的优势，在当年冬季就能鉴定出纯度结果，但在海南冬季短日照低温的条件下，对感光类型的杂交水稻品种的鉴定结果往往不太准确。正季种植鉴定结果准确度高，但时间明显滞后，从生产上重大种子纯度事故来看，当得知种子纯度不合格时，种子已流入市场，损失也已无法挽回。随着分子标记技术的发展，SSR分子标记检测技术被广泛应用于杂交种子的纯度鉴定中，SSR 标记是在水稻分子层面上鉴定，主要是利用不同水稻品种遗传组成不同，基因组DNA 中简单重复序列的重复次数有差异。通过PCR 扩增及电泳方法检测出差异，从而能够将不同品种精准区分。SSR 标记具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、实验操作简单、结果稳定可靠等特点[4]。

本研究利用SSR 标记技术对新配制杂交组合的双亲进行多态性筛选，分别筛选出在双亲之间显示出良好多态性的引物，然后对杂交种子进行纯度鉴定，同时进行田间种植鉴定，两种方法的结果进行比较来验证SSR 标记检测8 个杂交组合种子纯度的准确性。

1 材料与方法

1.1 试验材料亲本不育系为新育三系不育系6026A。亲本恢复系共计8 份：德恢6099、旌香占、粤禾丝苗、德恢5292、泸恢1611、R2195、R5004和R4149。

8 个杂交水稻新组合：6026A/德恢6099、6026A/旌香占、6026A/粤禾丝苗、6026A/德恢5292、6026A/泸恢1611、6026A/R2195、6026A/R5004、6026A/R4149。试验所用种子均是2020 年夏季新生产的杂交水稻种子。

1.2 基因组DNA 提取和检测采用简易CTAB法[5]提取水稻嫩叶片总DNA，并利用核酸检测仪检测提取DNA 样品浓度和质量。利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物。

1.3 筛选引物利用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR 标记法》中的48 对引物进行双亲多态性检测，引物由擎科生物科技有限公司合成。选用各组合多态性标记用于后续杂交稻种子纯度检测。

1.4 SSR 标记鉴别种子纯度利用双亲间具有多态性的SSR 引物，对200 株杂交种幼苗进行纯度鉴定，尽量选择2 对SSR 引物进行检测，扩增带型与标准带型不一致时，判定其为杂株。统计父本、母本和杂种种子数占被测种子数的比例。

1.5 田间种植鉴定种子纯度每个组合在海南田间分别种植200 株，单本栽插，栽插规格16.5cm×26.4cm。在整个生长阶段观察品种的特征特性，控制化肥和除草剂的使用剂量，以免影响植株本身的特征特性。在抽穗前及齐穗后依据GB/T 3543.5—1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》进行田间纯度鉴定，根据品种特征特性对明显杂株及可疑植株用掐叶的方法进行标记，并详细记录下杂株类型和数量[6]。

2 结果与分析

2.1 杂交组合引物筛选由表1 可知，经过对双亲间引物多态性筛选，在6026A/德恢6099 亲本间表现多态性的引物有RM208、RM232、RM17、RM493、RM2877、RM21 和RM3331；在6026A/德恢5292 亲本间表现多态性的引物有RM19、RM274；在6026A/R2195 亲本间表现多态性的引物有RM219、RM19；在6026A/R5004 亲本间表现多态性的引物有RM311、RM19；在6026A/泸恢1611亲本间表现多态性的引物有RM71、RM19；在6026A/旌香占亲本间表现多态性的引物有RM17、RM432；在6026A/R4149 亲本间表现多态性的引物仅有RM17；在6026A/粤禾丝苗亲本间表现多态性的引物有RM274、RM201、RM232。

表1 杂交稻组合及可用于纯度鉴定的SSR 标记

2.2 利用SSR 标记的杂交种纯度检测分别选取8 个杂交组合F1中的200 个单株，利用在6026A/德恢6099 双亲表现为多态性的2 个SSR 标记（RM208 和RM17）检测发现，有195 个单株在2 个标记座位上均呈现为双亲的互补带型，可判断为真实的6026A/德恢6099 F1种子，余下5 个单株在其中1 个标记座位上（RM17）呈现为双亲的互补带型，但在另外1 个座位上（RM208）表现为德恢6099 纯合型，说明该单株为混杂的其他杂合型材料（图1，表2）。利用6026A/德恢5292 双亲表现为多态性的2 个SSR 标记进行检测发现，有6个单株在2 个座位上（RM19 和RM274）表现为其他类型，其余194 个单株在此2 个座位上均呈现双亲的互补带型；利用6026A/R2195 双亲表现为多态性的2 个位点（RM219 和RM19）进行检测发现，有12 个单株在2 个座位上表现为其他型，其余188 个单株在此2 个座位上均呈现双亲互补带型；利用6026A/R5004 双亲表现为多态性的2 个位点（RM311 和RM19）进行检测发现，27 个单株在2 个座位上表现为其他型，其余173 个单株均呈现双亲互补带型；利用6026A/泸恢1611 双亲表现为多态性的2 个位点（RM71 和RM19）进行检测发现，有8 个单株在2 个座位上表现为其他型；利用6026A/旌香占在RM17 和RM432 位点上表现为多态性，检测发现5 个单株在2 个座位上表现为其他型；利用6026A/R4149 仅在RM17 位点上表现为多态性，检测发现仅有3 个单株表现为其他型，其他单株表现为双亲互补带型；利用6026A/粤禾丝苗在RM274 和RM201 位点上表现为多态性，检测发现7 个单株表现为其他型，193 个单株呈现双亲互补带型。

表2 杂交水稻种子SSR 纯度鉴定结果

图1 标记RM17 对6026A 和德恢6099及其杂交种纯度检测

2.3 田间种植鉴定结果同年冬季在海南基地种植各杂交组合200 个单株进行田间观察，从表3 结果发现，杂交组合6026A/R5004 发现3 株相近异形株，其生育期、植株形态与鉴定组合相似，只是叶边缘、叶鞘颜色和粒宽上有明显不同。其次，发现每个组合都有不同程度杂株，6026A/德恢6099与6026A/旌香占杂株类型主要表现为植株矮、生育期早以及完全不同形态的植株（疑是制种田飞花所致）；6026A/泸恢1611 和6026A/粤禾丝苗杂株类型主要表现为抽穗期迟、高株、株型差异大等；6026A/R2195、6026A/德恢5292 和6026A/R4149的杂株类型主要表现为株叶形态和籽粒性状上的差异。8 个组合中，田间纯度最好的是6026A/德恢6099，为95.5%；最差的为6026A/R5004，仅为81.5%，但所有组合的纯度整体还是较差，均达不到杂交稻96%的纯度标准。

表3 试验组合抽穗期及田间纯度结果

2.4 SSR 鉴定与田间种植鉴定结果对比比较表2 和表3 可以看出，SSR 鉴定与田间鉴定结果比较接近，差值范围2%～7%，各杂交组合田间种植纯度鉴定与SSR 鉴定纯度的趋势是一致的，而SSR 鉴定纯度结果比田间鉴定结果数值高（图2）。

图2 SSR 鉴定与田间鉴定的种子纯度对比

3 讨论

传统的种子纯度鉴定方法主要是田间种植观察鉴定，而田间种植鉴定的结果准确性受到鉴定者的技术经验、田间栽培管理水平、天气环境等因素影响[7]。随着DNA 分子标记技术不断发展，SSR 标记检测快速高效的优势使其在杂交水稻种子纯度鉴定中越来越广泛使用[8]。众多研究结果表明，SSR 标记检测与田间鉴定种子纯度均有一定差异，这种差异变化呈无规律性，主要因为SSR 鉴定针对单一的不育系、恢复系和混入的常规品种可以准确区分，但对于部分串粉混杂和变异株不容易区分，主要因为田间串粉混杂造成的杂株类型很复杂，部分杂株类型在单个SSR 标记可能没有表现出多态性，此外SSR 鉴定的准确性还受到DNA 提取质量、电泳操作和引物的影响；另一方面是因为田间种植鉴定的结果准确性受到鉴定者的经验、栽培管理、环境条件等因素干扰[9]。总体结果比较，SSR 标记检测和田间鉴定结果趋势相同，差异幅度较小[10]。对于现代种企而言，可以利用室内和田间鉴定相结合的方式，快速、精准、高效地鉴定杂交种子纯度，以保证推向市场种子的质量[11]。

本研究利用SSR 标记技术检测新配制的8 个杂交组合的种子纯度，并同田间鉴定结果相比较。研究结果表明，利用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR 标记法》中48 对标记，筛选出8 个杂交组合的共显性标记鉴定各杂交组合种子纯度，SSR 标记检测结果显示各组合的种子纯度在86.5%～98.5%之间，种子纯度比海南田间鉴定结果稍高，这种情况有可能是样本数或SSR 标记数较少的原因。整体而言，2 种方法鉴定结果较为相近，说明利用SSR 标记检测杂交组合种子纯度是可行的。因此，为保证杂交稻种子纯度，一是扩大样本量，二是选择多个共显性标记进行检测，但考虑成本及检测时间，应至少选取2 对及以上共显性标记进行检测，当2 个标记检测纯度一致时，检测结果更加准确。

本研究通过利用SSR 分子标记技术，筛选出可利用的共显性标记，形成了一套准确、快速、简单的鉴定杂交种纯度的技术体系，对新配制的8 个杂交组合种子纯度进行了快速鉴定，加快了育种工作进程。