基于质量源于设计（QbD）理念的滋肾通关胶囊醇提工艺质量控制研究

管 敏，施 敏

（南京中医药大学附属医院 制剂部，江苏 南京 210029）

滋肾通关胶囊是江苏省中医院基于古方开发的医院制剂，由黄柏、知母和肉桂三味常用中药组成，用于治疗肾虚湿热淋证，疗效明确[1-2]。同大部分中药制剂一样，滋肾通关胶囊目前的提取工艺是采用固定工艺参数的操作方式，提取工艺流程也存在一定的不合理性，从而影响制剂的质量稳定及工艺效率，影响临床使用的安全性和有效性，限制了其进一步开发与应用。为改善制剂均一性和稳定性，提高制剂工艺效率，本研究突破传统的以单一指标优选关键工艺参数点的制剂工艺研究模式，采用国际先进的质量源于设计（QbD）理念优化滋肾通关胶囊的提取工艺，运用风险、统计分析，Box-Behnken 设计等方法建立工艺-质量的关系模型，以“空间”代“点”，构建设计空间，将提取全过程控制在该空间内[3-4]，实现滋肾通关胶囊提取工艺灵活、稳定、高效，中间体质量可靠、可控，进而建立一套整体、科学、合理的中药制剂工艺研究方法，为中药制剂研究模式的新改革提供坚实的理论基础。

1 仪器与试药

Agilent 1260s 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BP211D 型十万分之一分析天平（德国Sartorius 公司）；1500L 型真空浓缩主罐（浙江温兄机械阀业有限公司）；黄柏（批号：20190901、20191002、20201202，贵州同德药业有限公司）；知母（批号：20020408、19012603、19030207，安徽协和成药业饮片有限公司）；所有饮片由江苏省中医院药学部主任中药师周琴妹鉴定，均符合 2020 年版《中国药典》（一部）相关项下的要求；黄柏碱（批号：200616，南京聚康医药化工有限公司）；芒果苷（批号：111607-201704，中国食品药品检定研究院）；盐酸小檗碱（批号：100453-200501，中国食品药品检定研究院，小檗碱含量均以盐酸小檗碱计），含量均大于98%；乙腈为色谱纯，水为纯净水，甲醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 滋肾通关提取液的制备

称取黄柏100 g，知母100 g，加入一定量的65%乙醇，浸泡适当时间，加热回流提取2 次，合并两次滤液，定容至适宜体积即得。

2.2 提取工艺关键工艺参数的筛选

首先采用失效模型与影响分析（Failure mode and effects analysis，FMEA），根据笔者在中药提取方面的经验以及文献资料的报道，对滋肾通关提取工艺在饮片、溶剂、提取操作、过滤操作方面所涉及的潜在关键工艺参数（Potential critical process parameters，pCPPs）进行风险评估，计算风险优先度（Risk priority number，RPN），RPN ＝S × O × D，其中 ，S 为严重度，O 为失效发生频度，D 为不可探测度[5]，结果见表 1。RPN 值越高风险越大，针对部分高风险因素进行单因素实验，最后选择溶剂倍数、浸泡时间、提取时间为 pCPPs。

表1 滋肾通关胶囊提取工艺中pCPPs 的风险评估Tab. 1 Risk assessment of pCPPs in the extraction process of Zishen Tongguan capsule

2.3 关键质量属性（Critical quality attributes，CQAs）的测定与分析方法

2.3.1 干浸膏得率的测定 精密量取滋肾通关提取液25 mL 至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥至恒定质量（3 h），置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算得到干浸膏得率。干浸膏得率（%）=（干膏重/饮片重）×倍数×100%。

2.3.2 黄柏碱、芒果苷和小檗碱的含量测定 （1）对照品溶液制备 精密称取黄柏碱对照品10.20 mg，加甲醇制成1 mL 含0.204 0 mg 的对照品母液；取盐酸小檗碱10.11 mg，加甲醇制成1 mL 含1.011 mg的对照品母液；取芒果苷对照品12.60 mg，加50%甲醇制成1 mL 含0.504 0 mg 的对照品母液。精密吸取黄柏碱母液5 mL、其余母液各1 mL 置于10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释，超声15 min，放冷后定容，混匀，0.22 μm 滤膜过滤，进样5 μL。

（2） 供试品溶液制备 精密吸取提取液1 mL于100 mL 容量瓶中，加50%甲醇适量，超声15 min，放冷后定容，混匀，0.22 μm 滤膜过滤，即得。

（3） 色谱条件 色谱柱：Inert Sustain TM C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min，柱温：30℃。流动相：0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）, 梯度洗脱见表2。

表2 洗脱梯度表Tab. 2 Gradient elution table

（4） 系统适应性及专属性考察 在“2.3.2（3）”项所述色谱条件下，供试品溶液中黄柏碱、芒果苷、小檗碱与相应对照品色谱峰的保留时间一致，各色谱峰均能较好分离，供试品中其它成分对待测成分无干扰，见图1。

图1 滋肾通关提取液HPLC 色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of Zishen Tongguan extract

（5） 线性关系考察 依法测定不同质量浓度的混合对照品溶液，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。分别得回归方程：黄柏碱（5.876 ～188 µg/mL）：Y= 8.432X+ 4.972（R2= 0.999 9）；芒果苷（5.812 5 ～186 µg/mL）：Y=16.30X- 4.056（R2= 0.999 9）；小檗碱（15.625 ～500 µg/mL）：Y= 21.40X- 3.726 1（R2= 1）。结果表明黄柏碱、芒果苷、小檗碱在相应的浓度范围内线性关系良好。

（6） 精密度试验 取“2.3.2（1）”项下对照品溶液，按“2.3.2（3）”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积， 计算得到黄柏碱、芒果苷、小檗碱对照品峰面积的RSD 分别是0.79%、1.49%、0.34%（n= 6），表明仪器精密度良好。

（7） 稳定性试验 取滋肾通关提取液适量，按“2.3.2（2）”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样测定，记录峰面积，计算得到供试品中黄柏碱、芒果苷、小檗碱峰面积RSD 分别为0.75%、0.88%、0.23%（n= 6），表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

（8） 重复性试验 取滋肾通关提取液适量，按“2.3.2（2）”项下方法制备6 份供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算得到供试品中黄柏碱、芒果苷、小檗碱峰面积RSD 分别为0.48%、0.57%、0.07%（n= 6），表明该方法重复性良好。

（9） 加样回收率试验 精密量取已知各成分含量的滋肾通关提取液0.5 mL 于100 mL 容量瓶中，加入含有黄柏碱0.86 mg、芒果苷1.515 mg、小檗碱7.24 mg 的对照品溶液，按照供试品制备方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，计算得到供试品中黄柏碱、芒果苷、小檗碱的平均加样回收率分别为103.46%、104.18%、103.93%，RSD 分别为0.95%、1.23%、0.57%（n= 6）。

（10） 统计学方法 数据的统计分析由Microsoft Office Excel 2013（Microsoft, USA） 软件完成；Box-Behnken 与设计空间的分析由Design-Expert 12 软件完成。

2.4 pCPPs 与 CQAs 的相关性研究

为探讨滋肾通关胶囊提取工艺中pCPPs（A：溶剂倍数、 B：浸泡时间、 C：提取时间）与CQAs（干浸膏得率、黄柏碱、芒果苷、小檗碱含量）的相关性，设计三因素三水平的Box-Behnken 实验[6-7]，Box-Behnken 实验设计与响应值见表3。采用Box-Behnken 推荐的回归类型对设计结果进行方差分析，结果见表4。由表4 可知，各工艺评价指标的分布范围较宽，证明本实验设计关键工艺参数的范围设置较为合理。干浸膏得率二次项回归总模型方差显著（P＜0.01），失拟值差异不显著（P＞0.05）；黄柏碱二次项回归总模型方差显著（P＜0.01），失拟值差异不显著（P＞0.05）；芒果苷一次项和二次项回归模型方差差异均不显著（P＞0.05），失拟值差异显著（P＜0.05）；小檗碱二次项回归总模型方差显著（P＜0.05），失拟值差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明干浸膏得率、黄柏碱、小檗碱的二次项回归总模型拟合度好，误差小，可用于预测和优化。

表3 Box-Behnken 设计与结果Tab. 3 Box-Behnken design and results

表4 Box-Behnken 设计方差分析Tab. 4 Box-Behnken design variance analysis

2.5 模型的建立及评价

采用二项式回归对评价指标及关键工艺参数分别进行拟合，回归方程如下：干浸膏得率= 30.54 +0.902 5A+ 1.61B+ 1.28C+ 0.242 5AB- 0.967 5AC-0.450 0BC-0.832 0A2-1.60B2+ 2.45C2；黄柏碱= 0.150 6 +0.010 9A+ 0.008 1B+ 0.027 4C+ 0.010 0AB+ 0.008 9AC- 0.008 9BC+ 0.009 0A2- 0.011 20B2- 0.010 9C2；

小檗碱 = 1.518 + 0.089 7A+ 0.789 0B+ 1.803 1C+ 0.079 1

AB+ 0.016 6AC- 0.047 6BC+ 0.112A2- 0.127B2-0.143C2。

干浸膏得率、黄柏碱和小檗碱的拟合相关系数R2分别为0.924 9、0.905 9 和0.848 0，Radj2分别为0.828 3、0.784 9、0.652 5，表明该回归模型具有较好的拟合度，该模型可接受。而芒果苷的拟合相关系数R2为0.398 5，表明该回归模型的拟合度较差。

2.6 响应面分析

根据各回归方程进行绘图分析，三维响应面图见图2，图的颜色从蓝色到红色的变化表示评价指标从少到多的变化，变化的越快表示坡度越大，即对试验结果的影响更为明显。由干浸膏得率的等高线图可知，提取时间的两幅图颜色变化快，表明提取时间对干浸膏得率影响更明显。黄柏碱和小檗碱的等高线图显示溶剂倍数对黄柏碱和小檗碱的含量影响更明显。

图2 干浸膏得率、黄柏碱、小檗碱的响应面分析图Fig. 2 Response surface diagram of dry extract yield phellodendine and berberine

2.7 设计空间的建立

根据医院制剂大生产的经验与需求，将优化目标设定为干浸膏得率在29% ～ 37%，黄柏碱含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗碱含量≥1.2%，在设定的工艺参数空间内选取符合条件的子集，构建设计空间并以Overlay Plot 展示，结果见图3。图中灰色区域为不符合要求的空间，浅灰色区域为风险空间，有5%可能不符合要求，黄色部分为符合要求的空间，在此空间内，滋肾通关提取物的评价指标均能符合设定的目标值。为进一步确保制剂的质量，结合生产情况，适当的缩小了设计空间，即为红色虚线框部分：滋肾通关胶囊提取工艺操作空间为溶剂倍数为7 倍 ～ 9倍，浸泡时间为11 ～ 20 h，提取时间为2.1 ～ 2.5 h。

图3 滋肾通关胶囊提取工艺的设计空间Fig. 3 Design space of extraction process of Zishen Tongguan Capsule

2.8 设计空间的验证性实验

取小试同一批次的饮片进行设计空间的验证。在设计空间图中选取5 个不同区域内的点来进行验证，5 点的选取及验证试验结果见表5。结果显示设计空间内的点均满足预设目标：干浸膏得率在29% ～37%，黄柏碱含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗碱含量≥1.2%，而空间外的点不能同时满足这五个目标，表明在设计空间内操作能保证提取工艺达到预期目标。

表5 小试规模下设计空间验证结果Tab. 5 Verification results of design space in laboratory tests

分别取符合2020 年版《中国药典》标准的其它2个批次知母（19030207、19012603）、黄柏 （20201202、20191002）在小试条件下进行工艺适应性验证，试验结果见表6，空间内的1、2 号的各指标均在目标值范围内；空间外3 号的干浸膏得率、黄柏碱低于目标值的范围。

表6 不同批次饮片设计空间验证结果Tab. 6 Verification results of design space using different batches of traditional Chinese medicine

分别取知母（19030207、19012603）、 黄柏（20201202、20191002）在中试条件（黄柏20 kg、知母20 kg、1 500 L 真空浓缩主罐）下按照表7 的条件进行工艺适应性验证。试验结果见表7，空间内三批中试所得提取液各指标均在目标范围内。

表7 中试规模下的设计空间验证结果Tab. 7 Verification results of design space in pilot scale

3 讨论

3.1 关键质量属性的选择

干浸膏得率与中药制剂的提取过程是直接相关的，能较好地反映提取效果。黄柏中小檗碱具有抗菌、抗炎、退热等活性，黄柏碱具有抑制炎症进展的作用，知母中芒果苷、新芒果苷和知母皂苷是清热泻火的主要有效成分，还具有免疫调节、抗氧化等作用[8-10]，以上各成分的药理活性与滋肾通关胶囊治疗肾虚湿热淋症（如：急性膀胱炎、肾盂肾炎等）的主要疗效相一致，黄柏碱、小檗碱和芒果苷的含量也是2020年版《中国药典》中“黄柏”“知母”项下的质控项目。在建立HPLC 同时测定多种成分含量的方法时，知母皂苷类需要采用蒸发光检测器检测，无法与其它成分同时测定，新芒果苷因其稳定性较差[11]，供试品中含量较低，无法满足含量测定的要求。因此，最终以干浸膏得率，黄柏碱、芒果苷和小檗碱的含量作为关键质量属性。

3.2 设计空间的确定

原料的质量差异是造成中药制剂质量不稳定的重要原因， 2020 年版《中国药典》规定，黄柏饮片中黄柏碱含量不低于0.34%，小檗碱含量不低于3.0%，知母饮片中芒果苷含量不低于0.40%[12]。基于此标准，结合医院制剂大生产的经验与需求，将优化目标设定为干浸膏得率在29% ～ 37%，黄柏碱含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗碱含量≥1.2%。

3.3 Box-Behnken 响应面结果分析

芒果苷拟合不显著的原因：经Box-Behnken 响应面法发现芒果苷一次项回归模型和二次项回归模型拟合度均不显著，表明预测值与实际值的吻合程度较低，芒果苷含量与提取工艺参数变化关系不明确。查阅文献[11]得知，知母中芒果苷含量较低且芒果苷在热的稀乙醇中溶解度较好[13]，因此推测芒果苷在较少提取溶剂、较短提取时间内即可基本提取完全，随着提取溶剂体积和提取时间的增加，芒果苷含量增加不显著。

3.4 设计空间的验证

本研究建立了滋肾通关胶囊的提取工艺空间，并进行进一步验证与完善。首先采用与小试同一批次的饮片进行验证，分别选择空间内（上、下边界处及中间）与空间外共五个点作为工艺条件，结果显示：工艺参数在空间内时，提取液的各指标均能达到设定目标；在空间外时，各指标不能同时达到设定目标。采用不同批次的饮片进行工艺适应性验证，结果表明，以符合2020 年版 《中国药典》标准的饮片为原料，工艺参数在空间内时，提取液各指标均能达到预设目标。最后进行三批中试规模的验证，所得提取液干浸膏得率和各成分转移率略高于小试，仍在预设目标范围内。所有空间内的验证实验结果显示：各批次提取液干浸膏得率及各成分含量的波动范围小于均值的10%。以上结果说明本研究建立的设计空间灵活、稳定、高效，基于该空间所得的滋肾通关提取液质量可靠、可控。

4 结论

本研究基于QbD 理念，采用失效模型与影响分析筛选关键工艺参数及关键质量属性，进一步采用Box-Behnken 设计优化滋肾通关胶囊的提取工艺，并结合生产实际确定了最佳工艺空间，可实现工艺灵活、稳定、高效，产品质量可靠、可控。