基于网络药理学探讨附子理中汤治疗非酒精性脂肪性肝病作用机制*

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已经成为全世界最常见的慢性肝病，全球患病率高达25%

。据统计，中国在内的部分亚洲国家NAFLD患病率已高于世界平均水平

。随着生活水平的提高和饮食结构的变化，中国的NAFLD患病率日趋上升且呈年轻化发展趋势。该疾病因高发病率、高患病率、低龄化发病趋势、慢性进展过程、伴发心脑血管等疾病、诱发肝硬化及肝癌等特点，突显其在临床及科研中的重要性。目前临床上尚无针对NAFLD的特效治疗药物。中医中药基于辨证论治对NAFLD 防治具有一定优势，其机理值得深入研究。

附子理中汤(FZLZD)原方出自宋代陈言所著的《三因极一病证方论》，谭茂卿等

研究发现FZLZD可以有效降低临床脂肪肝患者的血脂，改善肝脏酶学指标，缓解临床症状，可调节人体代谢及改变体质。已有动物实验及体外细胞实验证实FZLZD可有效促进NAFLD小鼠肝细胞的增殖，抑制其凋亡

。FZLZD疗效受到临床实践和基础研究的肯定，但其作用机制尚不明确。网络药理学(NP)融合了药理学理论和系统生物信息，将药物化合物成分及其作用靶点网络与疾病基因网络相结合，广泛运用于解释多种药物成分通过多途径作用于多个靶点的作用关系

。本研究基于网络药理学的基本思维及方法，构建FZLZD药物活性成分-靶点-疾病作用关系网络，探索FZLZD改善NAFLD的潜在作用机制，为FZLZD治疗NAFLD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 复方药物活性成分及作用靶点筛选 通过检索TCMSP数据库(http:// tcmspw. com/ tcmspsearch. php)获取FZLZD组成药物附子、甘草、人参、白术及干姜的所有化合物成分，设定口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为过滤条件，筛选出FZLZD组成药物潜在活性成分。检索TCMSP平台获取药物活性成分对应的靶点蛋白全名，并借助Uniprot平台(http//www.uniprot.org/)将药物活性成分作用的靶点蛋白全名转换为基因名。

1.2 疾病基因靶点的获取 以“Non-alcoholic fatty liver disease”为关键词检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(http://www.omim.org/)，获取NAFLD疾病靶点基因，与药物活性成分作用靶点进行匹配，即为FZLZD治疗NAFLD的潜在靶点基因。

(3)0～10 cm土层，0.05～0.25 mm和<0.0 5 mm粒径微团聚体有机碳对总有机碳有显著作用；10～20 cm土层，在1～2 mm、0.05～0.25 mm粒径，团聚体有机碳对总有机碳有显著作用；20～40 cm和40～60 cm土层有机碳对团聚体有机碳影响不明显。这与植物根系分布深度及耕作施肥深度有关，同时也说明了红壤有机碳的增加通过形成或进入小团聚体而实现。

2.5 KEGG通路分析 通过对共有基因的KEGG富集分析，共获得80条通路满足基因富集显著性

<0.01，根据KEGG数据库对信号通路的解释及NAFLD发病机制，最终筛选出与NAFLD相关的通路共25条，根据通路富集程度及显著性选取排名靠前的20个条目绘制高级气泡图(见图4)。富集程度较高的信号通路包括：糖尿病并发症中的AGE-RAG通路、细胞凋亡、NAFLD、TNF信号通路、胰岛素抵抗、IL-17信号通路及NF-κB信号通路，提示这些通路可能为FZLZD治疗NAFLD的重要通路。其中糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路富集程度和显著性均为最优，利用R 4.0软件取该通路图进一步分析，并用颜色标注本研究中靶点基因、该基因编码的酶及该类酶参与的反应，如图5所示,糖尿病并发症中的AGE-RAGE通路可能通过MAPK、PI3K-AKT信号通路等相关途径调控炎症反应、调节细胞凋亡，以达到治疗NAFLD的目的。

2.[tʂxui](这会儿)+[tala][f](说)[tʂie](这些)干吗呢？(现在还要说这些干什么呢？)

2012年党的十八大以来，以习近平同志为核心的党中央坚定不移地坚持高举改革开放旗帜、推进全面深化改革、扩大对外开放的战略决策部署，展现了党中央将改革开放进行到底的政治魄力和坚定决心。

2 结果

2.2 复方药物活性成分-靶点-疾病网络分析 根据药物成分、靶点与疾病之间的关系及属性，利用Cytoscape 3.7.2软件绘制药物成分-靶点-疾病网络图(图1)，图中共涉及125个节点，402条边。分析网络图可知，同一个靶点基因会同时受多种药物成分的影响，不同靶点也可受同一种药物成分干预。对药物成分及靶点进行拓扑属性分析显示，所有药物成分的度值(Degree)均大于1，平均度值为5.16，山柰酚、槲皮素、柚皮素、β-谷固醇、异鼠李素、甘草查尔酮A度值均大于度值均数；靶点中介中心性(Betweenness Centrality)平均值为0.0033，山柰酚、槲皮素、柚皮素、β-谷固醇、异鼠李素、甘草查尔酮A、苜蓿素7个节点大于该均值。其中，山柰酚和皮素度值和中介中心性均明显高于其他成分，这两种药物成分与多个靶点存在联系，提示该成分可作用于多个靶点，可能为FZLZD发挥药理效应的核心成分。

2.1 复方潜在活性成分及靶点的获取 通过检索TCMSP数据库，共获得142种药物潜在活性成分，其中21种来自附子，87种来自甘草，22种来自人参，7种来自白术，5种来自干姜；利用Uniprot平台将药物活性成分所对应的靶点蛋白全名规范为基因名，并删除重复项后共获99个靶点基因，与1 442个疾病靶点取交集处理，最终获取FZLZD治疗NAFLD潜在靶点43个。43个共有靶点对应的药物成分共80种，详细信息见表1。

随着肥胖症流行、糖尿病患病率的上升及人口老龄化，NAFLD的患病率以及晚期肝病患者的比例将继续增加，其影响将反映在更高的肝细胞癌(HCC)发生率、肝脏相关疾病死亡率和肝移植的需求上，这将给医疗卫生系统带来沉重的负担

。NAFLD是一种病因病机极其复杂的系统性代谢疾病。现代医学针对NAFLD的治疗，主要着眼于代谢危险因素及并发症的治疗，主要应用药物包括维生素E、乙酰半胱氨酸等抗氧化剂、二甲双胍等胰岛素增敏剂、他汀类调脂药、谷胱甘肽等降酶护肝药。这类药物作用靶点各不相同，因疗效不确定，或具有一定毒副作用，均未被证实是治疗NAFLD单一直接有效药物。中医药在治疗NAFLD方面进行了大量的探索性研究，诸多单味药、中成药及中药复方的疗效和安全性均得到证实。Meta分析发现中医药治疗NAFLD在改善血液生化指标及肝脏影像学表现方面优于西药对照组

。有学者认为，药物联合治疗NAFLD必然是未来研究的新思路，针对不同靶点及多层次靶向联合治疗是未来干预NASH的发展方向

。中药复方基于多种活性成分的物质基础，作用于多个靶点基因发挥其疗效，具有独特的临床和科研价值。

2.4 GO富集分析 GO富集分析结果中显著性

<0.01的条目包括735个BP、43种MF、30类CC。根据其富集程度与显著性，每个模块筛选出前10个条目绘制柱状图(图3)。参与BP主要有无机物的反应、细胞因子介导的信号通路、对酸性化学物质的反应、对类固醇激素的反应、对凋亡信号通路的调节等；MF中蛋白激酶结合、DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶II特异性、蛋白质均聚活性、脂质结合等排位靠前；参与CC的主要有膜筏、内质网腔、转录因子复合体、受体复合体、黏附连接等。

石英占矿物总量的56.1%，主要呈他形、半自形粒状以及粒状集合体分布(图1a、图1c)，粒度约为0.1～8 mm。黄铁矿、黄铜矿、闪锌矿和磁黄铁矿等硫化物矿物常分布于石英粒间以及多个石英颗粒组成的粒间孔洞中；黄铜矿、闪锌矿和方铅矿等硫化物矿物集合体常发育于石英裂隙和粒间孔洞中(图1a、图1b)，由于受到应力作用的影响，粒径较大的石英常具波状消光及应力裂纹。

1.4 共有靶点GO及KEGG富集分析 将共有靶点导入Metascape(https://metascape.org/gp/index. html#/main/step1)数据库分别进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。利用R 4.0软件可视化处理，对KEGG结果中重要通路进行分析。GO富集分析从分子功能(MF)、细胞组分(CC)和生物过程(BP)3个模块进一步分析各靶点的生物学功能富集情况。借助微生信(http// www. bioiformations. com. cn/)在线平台绘制GO柱状图和KEGG气泡图。

1.3 构建FZLZD药物成分-作用靶点-疾病及蛋白互作网络 将FZLZD和NAFLD共有靶点导入String数据库(https://string-db.org/ cgi/ input. pl)，检索结果以TSV格式导出，随后导入Cytoscape 3.7.2软件中构建蛋白互作网络图(PPI)，同时进行网络的拓扑属性分析，以预测FZLZD组成药物作用于NAFLD的潜在关键成分和关键靶点。同时运用Cytoscape 3.7.2软件构建FZLZD药物活性成分-靶点-疾病网络图。

3 讨论

2.3 PPI 网络分析 String 数据库联合Cytoscape 3.7.2 软件，根据拓扑分析参数度值设定节点大小，连线粗细表示相邻节点相关性强弱，构建PPI网络(图2)，PPI 网络中共有43个节点，258条边，其中度值最大的几个靶点分别为:IL6(31)、VEGFA(26)、CASP3(23)、MAPK8(23)、ESR1(22)、PPARG(21)，此6个节点中介中心性也高于其他节点，提示这些靶点在FZLZD对NAFLD的治疗中具有重要意义，可能为FZLZD干预NAFLD的关键靶点。

本研究从FZLZD中筛选出的主要活性成分中山柰酚、槲皮素在PPI网络中连接靶点个数最多，可能为FZLZD治疗NAFLD的主要活性成分。山柰酚对肥胖、脂代谢、碳水化合物代谢和氧化应激等都有明显的作用，在对乙酰氨基酚诱导的肝细胞凋亡实验发现，山柰酚通过调控p-JNK和Endo G的表达水平以拮抗细胞凋亡

。研究证实槲皮素对NAFLD有一定的治疗作用,其作用机制主要包括抗氧化应激作用、调控促炎因子相关基因、减少脂质的合成以及改善胰岛素抵抗等

。二者均通过多种途径起到对NAFLD调节的重要作用。在GO富集分析中，靶点主要参与无机物的反应、细胞因子介导的信号通路等生物学过程，蛋白质均二聚活性、DNA结合转录激活剂活性等分子功能，膜筏、内质网腔等细胞组分,涉及调控转录、炎症、细胞凋亡、代谢、黏附连接等多种生物功能。这些靶点蛋白并非单独产生作用，而是相互协调，共同发挥作用。

研究表明，靶点拓扑分析Degree值越高，代表该类靶点具有更好的连通性及对整个网络的调控

。 本研究中Degree值排名靠前的几个靶点IL-6、VEGFA、MAPK、CASP3、ESR1、PPARG靶点可作为后期研究的候选关键靶点。KEGG分析结果与NAFLD相关的通路多达25条。通路与靶点结合分析发现，IL-6分别富集在AGE-RAG、NAFLD信号通路上，该靶点已被证实是参与NAFL向NASH和肝硬化转变进程中最重要的促炎症因子之一

。从NASH进展到非酒精性肝纤维化进程中一个重要特点是白细胞以及肝窦内皮细胞的粘附明显增多。MAPK8富集于细胞凋亡、NAFLD信号通路，该靶点可通过酶促磷酸化级联反应参与到细胞分化、发育等多阶段的调控过程中

。CASP3富集于AGE-RAG、NAFLD信号通路,作为抗凋亡信号分子，多种细胞凋亡路径均依赖该位点，通过下调因子水平、激活通路中下游启动型Caspase引发Caspase级联反应介导细胞凋亡

。

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富集程度和显著性最优的通路为糖尿病并发症中AGE-RAG信号通路。NAFLD与糖尿病互为危险因素。一项研究发现糖尿病并发症中AGE-RAG通路相互作用可促进NAFLD进展为脂肪性肝炎、肝纤维化

。另一研究证实，丹酚酸A可通过抑制糖尿病并发症中AGE-RAG通路，预防NAFLD并发的糖尿病性肾病

。从KEGG数据库中通路图分析可知，该通路可能通过MAPK、PI3K-AKT等分支通路改善炎症、调节细胞凋亡参与NAFLD调控，具体效应有待进一步研究。重要靶点CASP3、AMPK8以及PPARG均富集于AMPK信号通路，通过调控胰岛素敏感性和脂质代谢的核受体发挥改善NAFLD的作用。已有动物实验表明，FZLZD能通过激活 AMPK 通路进而抑制SREBP-1c，FASN的表达以及抑制NF-κBp65通路进而降低炎症因子以达到改善 NAFLD 大鼠肝脏病理变化、降低血脂水平、改善肝功能的目的

。此外，VEGFA富集于PI3K-Akt信号通路，通过局灶性增加白细胞以及肝窦内皮细胞粘附参与NAFLD的进展

。本研究中还包括胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、内分泌抵抗等相关路径，这些通路均与胰岛素抵抗相关，这一结论与胰岛素抵抗被认为是NAFLD发生发展关键机制的研究结果相符

。

综上所述，本研究中FZLZD可能通过80种药物活性成分作用于43个靶点基因、参与808个生物学功能及25条信号通路发挥其治疗NAFLD的药理作用。明确了FZLZD治疗NAFLD的分子基础，初步探究其作用机制，为中医辨证论治和方药配伍等传统理论提供科学依据。

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