基于IKK/IKB/NF-κB信号通路探讨理中汤加味联合穴位埋线干预非酒精性脂肪性肝炎大鼠的作用机制*

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是与遗传易感和代谢功能障碍密切相关的脂肪性肝病，疾病谱包括单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝纤维化和肝硬化

。流行病学调查结果显示，世界范围内普通人群NAFLD发病率已达28.01/1 000人年～52.34/1 000人年

。而在国内，随着肥胖和代谢综合征的流行，NASH的发病率逐年上升，已成为我国第一大慢性肝病

。目前NASH缺乏理想的治疗药物，研究证实了中医药治疗NASH的显著疗效

。前期的文献和临床研究结果表明，NASH发病的关键在于脾胃升降功能失职，据此我们采用理中汤加味联合背俞穴位埋线治疗NASH，这种联合治疗方案疗效较单纯中药或单纯背俞穴位埋线治疗的疗效更加显著且疗程缩短

。核因子-κB( NF-κB) 是一种重要的转录调节因子，在肝脏炎症反应、免疫应答、细胞生存和增生等方面发挥重要的调节作用

。NF-κB通过一系列信号转导途径被激活，进而促进炎症因子的释放，最终导致肝细胞坏死，激活炎症级联反应

。抑制IKK/IKB/NF-κB信号通路的激活是减轻肝组织炎症反应的关键

。本研究利用理中汤加味联合穴位埋线干预NASH模型大鼠，观察其治疗效果，探寻可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及造模 SPF级健康SD雄性大鼠70只，体质量(120±20)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号SCXK(湘)2016-0002]。适应性喂养7 d后，随机选10只作为空白组，其余60只以高脂饲料(胆固醇2%+猪油4%+标准饲料58%)喂养12周制备NASH大鼠模型。第12周末随机处死10只大鼠进行肝组织活检，组织病理切片阳性提示NASH造模成功；造模成功后，剩余50只大鼠随机分为模型组、中药+埋线组、穴埋组、中药组、维生素E软胶囊(西药)组，每组10只。实验动物按照国家实验动物管理规定进行饲养和实验。

1.2 主要试剂和仪器 大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(美国invitrogen公司)；Anti-IL6 抗体ab9324、Anti-IL1β抗体ab9722、Anti-NF-κB p65抗体ab16502、Anti-TNF-α抗体ab6671、Anti-IKK -α抗体ab32041(英国acbcam公司)；低温冰箱(Thermo Forma 702)；光学显微镜(日本Olympus 公司)；DYY-电泳仪、凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad)；7170S型全自动生化分析仪、低温离心机(日本日立公司)。

1.3 实验药物 理中汤加味：人参、山药、赤芍、丹参、山楂、首乌、益智仁、白芍各20 g，干姜、白术、炙甘草、茯苓、泽泻各15 g，苍术、陈皮、厚朴各10 g。上述药品均为农本方颗粒[培力(南宁)药业有限公司生产]，购于柳州市中医医院中药房，上方加500 ml蒸馏水煎煮，直至每2 ml药液中的生药含量约8.75 g。维生素E软胶囊(桂南药股份有限公司)。

1.4 干预方法 空白组大鼠正常饲养，模型组大鼠予高脂饮食至干预结束，埋线组大鼠参照文献

，选取双侧脾俞、胃俞、肝俞、肾俞，常规皮肤消毒后，先从左侧开始，用埋线针将长0.5 cm 0号羊肠线埋入穴位，同法操作右侧，1次/周。中药组大鼠予理中汤加味混悬液8.75 g·kg

·d

灌胃给药，1次/d。中药+埋线组大鼠联合中药组、埋线组治疗方法进行治疗。西药组大鼠予维生素E软胶囊250 mg·kg

·d

灌胃，1次/d。连续干预4周，期间继续高脂饮食喂养。

1.5 观察指标 ①观察大鼠一般情况，包括精神状态、毛色、活动、大便、饮食、饮水等。②检测大鼠肝指数，肝指数=肝脏湿质量(g)/大鼠体质量(g)×100%。③测定血清中肝功能(ALT、AST)、血脂(TC、TG、LDL-C)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)含量。胰岛素抵抗指数按稳态胰岛素评价指数(HOMA-IR)计算，计算公式为HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。④HE染色观察肝组织形态。⑤检测血清 IL-1β、IL-6、TNF-α含量。⑥检测肝组织中IKK-α、NF-κB p65、IL-1β 、IL-6、TNF-α蛋白表达情况。

区县级电视台不重视优秀人才培养，在制作电视专题节目时往往缺乏相应的奖罚机制，没有将地区优点以及特色体现出来，在节目题材选择上存在缺乏吸引力的状况，其所使用的多媒体技术以及相应的节目制作技术还存在着很大的提升空间，在宣传方式和制作内容上都还需要进一步提高。

2.6 各组大鼠 IKK-α、NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达情况 见图2、3。

2.1 各组大鼠一般情况 空白组大鼠毛发色正常,活动敏捷,精神、纳食、二便均正常,对外界反应灵敏。模型组及各干预组大鼠随着喂养周期延长，体质量出现进行性增加，毛发杂乱、色暗，纳食减少，大便溏，精神倦怠，少动，对外界刺激反应迟钝。干预后，各干预组大鼠进食、饮水及大便稀溏症状有所好转,体型肥胖不同程度减轻，大鼠毛色、精神、活动等方面均改善。其中中药+埋线组大鼠在活动、动作、纳食、二便、精神等方面，与空白组比较，肉眼观察无明显差异。

2 结果

在冬棚虾养殖生产过程中不稳定因素有很多，如气候、天气、水质、底质变化，苗种、管理等。如何保持稳定，提高成活率？

2.2 各组大鼠肝脏组织形态变化情况 空白组大鼠肝小叶结构正常，未见明显脂肪变性及炎性细胞浸润。模型组大鼠肝组织重度脂肪变，肝细胞有较大脂肪细胞广泛浸润，呈“气球状”改变，可见肝小叶内为主的大量炎性细胞浸润。中药+埋线组大鼠肝脏脂肪变性不同程度减轻，肝细胞有再生现象，炎性细胞明显降低甚至消失。埋线组大鼠肝脏脂肪变性程度有所减轻，肝细胞再生，炎性细胞减少。中药组大鼠肝脏病理组织学变化性质与埋线组相似。西药组大鼠肝脏有脂肪变性和“气球征”，肝小叶内有少量炎性细胞浸润，见图1。

2.5 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α情况 见表3。

2.4 各组大鼠肝功能、血脂、HOMA-IR情况 见表2。

2.3 各组大鼠体质量、肝湿重、肝指数情况 见表1。

雪萤一怔：“江老师这不是带给你了吗？”狗子说：“他今天才给我的。以前那么久，他都没给我。你一定是才买的。”雪萤哭笑不得，说：“是是是，阿姨太忙，忘了，对不起。”

3 讨论

NASH以肝细胞脂肪变合并肝小叶内炎症和肝细胞气球样变性或伴有纤维化为特征，是非酒精性单纯性脂肪肝进展至肝硬化及肝细胞癌的中间阶段

。NASH治疗的目标是阻止、延缓或逆转疾病进展。NASH作为NAFLD发展的重要中间环节，是干预治疗NAFLD的靶阶段。目前NAFLD的主要治疗方式包括改变生活方式、针对代谢综合征的药物以及减肥手术，然而这些治疗难以使NASH逆转，目前尚无公认的特效药可以推荐作为NASH的常规治疗

。近些年，中医药在治疗NAFLD方面取得了可喜的成绩，大量的临床和基础研究均表明中医药对NASH有明显疗效

。NASH的发生源于脾胃对饮食中的水谷精微的运化和输布异常，最后导致痰、湿、浊、瘀、热蕴结肝体，导致本病的发生，因而本病发生的关键在于脾胃升降功能失职

。且团队通过对古籍文献的整理发现，历代医家治疗NASH多集中于温阳、健脾、祛湿、理气等方面

。据此我们使用理中汤加味治疗NASH患者，并取得一定的疗效。理中汤源于《伤寒论》，是治疗脾胃运化失职的经典方剂。我们在理中汤温脾健运基础上，加用茯苓、山药益气健脾；苍术、陈皮、厚朴祛湿化痰、行气和胃；赤芍、丹参、山楂清热凉血散瘀；益智仁、泽泻温肾降浊；首乌、白芍养血柔肝。诸药合用，以求标本兼治。前期研究发现，脾升胃降功能失衡的经络病机根本为任督二脉经气的升降交汇失衡，背俞穴位埋线可通过调节任督二脉经气之升降交汇，进而调理脾胃升降。穴位埋线有别于普通针刺的是其通过在固定穴位上埋入可吸收的羊肠线，达到持续刺激的作用，作用刺激更强，作用时间更久，疗效更好。通过对肝俞、脾俞、胃俞、肾俞进行长期持续刺激作用，可提高其兴奋性和传导性，调节任督二脉经气之升降交汇，进一步发挥调理脾胃之功能。本研究结果显示，干预后中药+埋线组大鼠在进食饮水、体质量、精神及活动等方面较其他干预组改善更为明显。这可能与干预后大鼠脾胃恢复运化功能有关。

此外，除了晴雯与黛玉相似，我认为妙玉与黛玉也具有可比性，她们都是姑苏人，妙玉也是一个有钱人家的子弟，她小时候也遇到了僧道，僧人建议她出家，最终妙玉选择了代发修行，此外，她们都擅长写诗，而且妙玉对宝玉也有一定的情愫，所以黛玉和妙玉也有可比性。

高脂饮食能引起血清中游离脂肪酸(FFA)增加，FFA在体内不断积累引起肝损伤，细胞膜通透性增高，导致细胞中ALT、AST溢出进入血液

，引起血清中ALT、AST含量上升。NASH的“多重平行打击”发病机制已被广泛接受。以IR为中心引起的肝脏脂肪浸润产生大量FFA，机体氧化途径无法处理过量FFA则会诱导TG及TC的合成，引起肝细胞脂质过度积聚诱发脂肪变性

。同时FFA增多又可诱导活性氧簇物质(ROS)的增加

。持续存在的ROS可以激活肝脏中Kupffer细胞(KCs)，释放大量的细胞因子，如NF-κB。同时，IKK-α被肝组织中过量积累的FFA激活，通过激活IKK复合体将IκB蛋白磷酸化，使其蛋白酶体降解，促使NF-κB 磷酸化并转运入细胞核，活化的NF-κB 在细胞核内调控TNF-α、IL-6和IL-1β等相关炎症细胞因子大量产生

，引起炎症细胞浸润，而同时NF-κB活化后释放出来的炎症因子可再次作用并激活NF-κB，放大炎症反应级连，形成恶性循环

，促进和加重NASH的发生和发展。本实验结果表明，中药+埋线组大鼠较其他干预组HOMA-IR、TG、TC、 LDL-C 、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平及肝组织IKK/IKB/NF-κB 信号通路相关蛋白表达下降更显著。提示理中汤加味联合穴位埋线可能改善NASH大鼠胰岛素抵抗，降低血脂水平，调节脂质代谢，抑制IKK/IKB/NF-κB 信号通路活化，进而抑制炎症反应保护肝脏。

[1] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)[J].实用肝脏病杂志，2018,21(2):177-186.

[2] Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D,

. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes[J]. Hepatology,2016,64(1):73-84.

[3] 潘勤,范建高.肠源性高血氨在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用[J].实用肝脏病杂志,2020,23(6):761-764.

[4] 黄鸿娜,符燕青,黄晶晶,等.非酒精性脂肪肝中医药治疗进展[J].辽宁中医杂志,2020,47(11):201-203.

[5] 周晓玲,谢胜,肖文胜，等.穴位埋线结合强肝消脂饮对非酒精性脂肪肝血清瘦素水平及胰岛素抵抗指数的影响[J].中国中医急症,2010,19(11):1845-1847.

[6] Marra F.Nuclear factor-kappaB inhibition and non-alcoholic steatohepatitis:inflammation as a target for therapy[J].Gut, 2008, 57:570-572.

[7] 高婵婵,李京涛,魏海梁,等.基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨M1型巨噬细胞极化在肝硬化-肝性脑病发病中的研究进展[J].现代消化及介入诊疗,2020,25(10):1321-1323，1328.

[8] Wei J, Shi M, Wu WQ,

.IkB kinase-beta inhibitor attenuates hepatic fibrosis in mice[J].World J Gastroenterol,2011,17 (47):5203-5213

[9] 郑利岩,张小倾,王熙,等.实验大鼠常用经穴检测与定位[J].辽宁中医杂志,2010,37(10):2058-2060.

[10] Younossi ZM,Stepanova M,Anstee QM,

.Reduced patient-reported outcome scores associate with level of fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2019,17(12):2552-2560.

[11] 李红山,应豪,贺晓立,等.祛痰活血方治疗非酒精性脂肪性肝炎的临床观察[J].中华中医药学刊,2018,36(7):1554-1556.

[12] 吕宝伟,冯春青,孙建光.补肾降浊饮对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗的影响[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(12):107-113.

[13] 中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.非酒精性脂肪性肝病中西医结合诊疗共识意见(2017年)[J].中国中西医结合消化杂志,2017,25(11):805-811.

[14] 李泽鹏,池晓玲,周晓玲,等.基于古籍整理的脂肪肝历代方药证治分析[J].中华中医药杂志,2016,31(10):4307-4308.

[15] 李泽鹏,池晓玲,周晓玲,等.清代古籍中脂肪肝方药证治探析[J].时珍国医国药,2019,30(3):731-732.

[16] 周晓玲,谢胜,肖文胜,等.强肝消脂饮对非酒精性脂肪肝血清瘦素水平及胰岛素抵抗指数的影响[J].辽宁中医杂志,2010,37(11):2174-2175.

[17] Ma Z,Chu L,Liu H,

.Beneficial effects of paeoniflorin on non-alcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in rats[J].Sci Rep,2017,7:44819.

[18] Qureshi K，Abrams GA．Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disea-se[J]. World J Gastroenterol，2007，13:3540-3553.

[19] Ye Q,Wang X,Wang Q,

.Cytochrome P4502E1 inhibitor,chlormethiazole,decreases lipopolysaccharide-induced inflammation in rat Kupffer cells with ethanol treatment[J].Hepatol Res,2013,43(10):1115.

[20] SUN SC. The noncanonical NF-κB pathway[J]. Immunol Rev,2012,246(1):125.

[21] Morgan MJ, Liu ZG. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-κB signaling[J]. Cell Res,2011,21(1):103-115.