通过网络药理学和动物实验探讨苦黄颗粒治疗非酒精性脂肪性肝病的作用机制*

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的一种临床病理综合征，主要病理特征是弥散性肝细胞大泡性脂肪变性和脂肪贮积，疾病谱有非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪性肝硬化

，可发展至肝衰竭或肝癌。目前NAFLD的发病机制并不明确，其中“二次打击学说”和近年兴起的“多次打击学说”能够在一定程度上解释NAFLD的疾病进展过程，涉及胰岛素抵抗、氧化应激、脂质过氧化、炎症等反应过程

。目前现代医学的治疗手段主要是改善胰岛素抵抗和保肝抗炎，常用药物有熊去氧胆酸、维生素E、还原型谷胱甘肽等，中药治疗通常以保肝抗炎为主

。

苦黄颗粒由苦参、大黄、茵陈、柴胡、大青叶5味中药组成，源于医圣张仲景名方“茵陈蒿汤”，是治疗湿热黄疸的名方，具有清热利湿，疏肝退黄的作用，临床使用过程中发现，苦黄颗粒除了在退黄、降酶、改善患者症状、体征方面有良好的疗效外，还能够调节机体免疫功能、改善肝损伤和炎症反应

。笔者基于网络学理学和动物实验，探讨苦黄颗粒对NAFLD的作用潜力与机制。

1 材料与方法

1.1 苦黄颗粒的活性化合物筛选 利用TCMSP 数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索苦黄颗粒组方中柴胡、大黄、苦参、茵陈和大青叶的主要化学成分，根据药物的吸收、分布、代谢、排泄参数进行筛选，选择口服利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18的活性化合物

，并参考增加《中国药典》记载的药材指标成分，最终筛选获得苦黄颗粒的主要活性化合物。

1.2 苦黄颗粒治疗NAFLD的靶点预测

1.2.1 苦黄颗粒活性化合物的靶点筛选 在TCMSP 数据库中检索苦黄颗粒主要活性化合物的作用靶点，未检索到靶点的活性化合物，再通过检索Smiles结构式依次在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

、Swiss Target Prediction数据库

(http://swiss-targetprediction.ch/)、SEA数据库(http://sea.bkslab.org)和STITCH数据库(http://stit-ch.embl.de/)进行靶点检索

；合并最终靶点结果并删除重复值。利用String数据库(https://string-db.org/)和Uniprot数据库(http://www.uniprot.o-rg/)将检索到的靶点统一为基因名(gene symbol)

。

通过函数调用，将上市公司全称与境外投资企业名称进行精确匹配；处理上市公司名称，删除 “集团”、“股份”、“控股”、“有限”、“公司”等字样，再一次进行模糊匹配；进一步利用关联交易文件确定上市公司与对外直接投资企业间是否存在关联关系。本文认为其母子公司或同一集团控股子公司间接参与对外直接投资活动，符合本文研究上市公司对外直接投资活动对整个企业集团绩效影响的初衷。

1.2.2 NAFLD的相关靶点筛选 以“Non-alcoholic fatty liver disease”为关键词，挖掘DisGeNET数据库(http://ww-w.disgenet.org和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中的疾病靶点

，合并检索结果，删除重复项，并将检索到的靶点统一为基因名。

重要靶点的KEGG通路富集分析显示有96条相关通路，均

<0.01提示NAFLD为关联度较高的疾病之一，HIF-1、TNF、Toll样受体、FoxO等信号通路可能为关键通路。

2.3 潜在靶点PPI网络分析 苦黄颗粒治疗NAFLD的潜在靶点导入String数据库中，得到苦黄颗粒治疗NAFLD的PPI网络图。最终PPI网络包含105个靶点，2138条边，平均网络节点度为40.7，平均局部聚类系数(表示节点的聚集程度)为0.688，结果表明该PPI网络中每个靶点平均约有40个靶点与之相连，并且网络中各靶点之间关联性较强。PPI网络中按照“degree值大于均值”的标准筛选出重要靶点51个， 其中INS(91)、Alb(86)、IL(82)、AKT1(81)、TP53(79)和TNF(76)为度值最高的6个靶点，可能是苦黄颗粒治疗NAFLD的关键靶点。

1.5.2 药物-化合物-靶点-通路网络构建 将单味药、关键化合物、核心靶点及KEGG通路TOP20的数据导入Cytoscape，构建药物-化合物-靶点-通路网络

。

刺玫果水提物的制备：用8倍体积的水浸泡过夜,回流1h，反复回流提取3次，合并滤液，浓缩，冻干成粉备用。刺玫果醇提物的制备：用8倍体积的浓度为70%醇回流提取刺玫果，回流1h，反复回流3次，合并滤液，浓缩，冻干成粉备用。

1.5 化合物-靶点拓扑分析与药物-化合物-靶点-通路网络构建

1.5.1 化合物-靶点拓扑分析 将化合物、交集靶点导入Cytoscape软件生成化合物-靶标网络图，进行网络拓扑分析，获得各节点的度中心性(DC)、中间中心度 (BC)、紧密中心性(CC)以及拓扑系数(TC)等参数，根据“节点DC、BC、CC、TC值大于中位数”为标准筛选出重要靶点，与1.3中的重要靶点取交集，获得核心靶点与关键化合物

。

1.4 潜在靶点的GO分析和KEGG通路富集分析 将PPI蛋白相互作用网络得到的重要靶点导入David数据库

(https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO富集分析及KEGG通路富集分析，将pvalue≤0.01作为通路聚类标准，筛选出显著的前20条生物功能和前10条显著的信号通路分别利用ImageGP平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/)进行可视化。

1.6 苦黄颗粒对高脂饲料复合CCl

脂肪肝模型小鼠肝组织中TNF-α、TLR4、Myd88表达的体内实验

2.1 苦黄颗粒活性化合物筛选结果 经TCMSP数据库检索并合并药典指标化合物，收集到活性化合物共计109个，其中因无法检索到靶标剔除活性化合物19个，最终得到活性化合物柴胡16个、大黄17个、苦参32个、茵陈15个、大青叶10个，其中柴胡、茵陈共有成分2个(异鼠李素、青蒿素A)，柴胡、苦参、茵陈共有成分1个(槲皮素)，大黄、茵陈、大青叶共有成分1个(β-谷固醇)，最终获得苦黄颗粒组方活性化合物84个。

1.6.2 方法 ①高脂饲料复合CCl

脂肪肝小鼠模型：C57BL/6小鼠，高脂低蛋白质饲料复合CCl

染毒8周模型，随机分为正常组、模型组、苦黄组。正常组小鼠普通饲料喂养8周。模型组与苦黄组小鼠均用高脂饲料喂养，喂养2周后，第3周首剂腹腔注射50% CCl

2ml/kg，第4周开始每周1次腹腔注射10% CCl

, 2 ml/kg。同时第4周开始苦黄浸膏粉生物等效量灌胃。苦黄颗粒人用量18 g/d，小鼠用量按照70公斤成人用量的10倍量计算，生物等效量=18 g/70 kg×10倍=2.57 g/kg鼠重/d。浸膏粉出膏率为0.6，用水配置308 mg/ml苦黄溶液，苦黄组小鼠每10 g鼠重，灌胃0.05 ml。②血清肝功能检测：ALT、AST测定采用赖式比色法。③肝组织病理染色：肝组织4%甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯、多级乙醇脱蜡至水，作HE染色。④RT-qPCR法测肝组织中TNFα、TLR4、Myd88表达：小鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠3 ml/kg麻醉抽取下腔静脉血、取肝，-70℃低温保存。用上述试剂盒提RNA、逆转录、PCR实验。

2 结果

1.6.1 材料 ①动物：C57BL/6小鼠，雄性，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心。②药物：苦黄颗粒浸膏粉，购自苏州雷允上药业有限责任公司。③试剂：总RNA抽提试剂盒(Cat No.B511321)、逆转录试剂盒 PrimescriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(CatNo.RR047A)、TBGreenTM Premix EX TaqTM 扩增试剂盒(Cat No.RR420A)，以上试剂均购自日本TaKaRa 公司；引物购于上海生工生物工程股份有限公司，信息见表1。

2.2 苦黄颗粒治疗NAFLD的潜在靶点 利用化合物名称在TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、SEA和STITCH数据库进行检索，将检索到的化合靶点利用String和Uniprot进行标准化，获得苦黄颗粒化合物靶点462个。运用DisGeNET和GeneCards数据库检索疾病相关靶点，筛选GeneCards数据库中“relevant score ≥25”的靶点和DisGeNET数据库“score≥0.1”的靶点，删除重复之后获得NAFLD靶点308个。将化合物靶点和疾病靶点取交集得到105个苦黄颗粒治疗NAFLD的潜在靶点。

1.3 潜在靶点的蛋白质-蛋白质互相作用(PPI)网络的构建 在String数据库中导入苦黄颗粒治疗NAFLD的潜在靶点

，选择基因物种为人(Homo sapiens)，最小相互作用阈值设置为“medium confidence”(>0.04)，获得PPI网络

；导出分析结果，统计各靶点的节点度值，筛选出重要靶点。利用Metascape平台(https://metascape.org/)分析得PPI网络各靶点密集连接的网络模块。

2.4 潜在靶点的GO分析与KEGG通路富集分析 利用DAVID平台对苦黄颗粒51个重要靶点进行GO分析，涉及的生物过程有RNA聚合酶II启动子转录的正向调控，对雌二醇、乙醇等药物的反应，基因表达的正向调控，凋亡过程的负调控，脂多糖介导的信号通路，衰老，血管生成，炎症反应等过程；相关的分子功能有酶、转录因子、蛋白质和蛋白激酶等物质的结合，细胞因子、生长因子等物质的活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合及其特异性DNA结合等；与之关联的细胞成分有蛋白质复合物、胶质溶胶、细胞质外泌体、线粒体、核质等部分。

1.2.3 苦黄颗粒治疗NAFLD的靶点筛选 利用韦恩图获取苦黄颗粒活性化合物靶点和NAFLD靶点的交集，获得苦黄颗粒治疗NAFLD的潜在靶点。

2.5 苦黄颗粒治疗NAFLD的药物—化合物—靶点—通路网络及拓扑分析

2.5.1 化合物-靶点网络拓扑分析 利用Cytoscape对网络中的节点进行拓扑分析，网络Node Degree Distribution拟合度(Correlation=0.973，R-squared=0.812)显示拟合质量好，精确度较高；结果显示，所有节点的DC、BC、CC、TC的中位数分别为4、0.00271969、0.31958763和0.36129032，按照“节点的DC、BC、CC、TC值大于中位数”筛选出核心化合物10个(甘草酚、菜豆蛋白、青蒿素A、儿茶素等)。根据核心化合物信息及PPI筛选出的重要靶点，最终获得核心靶点14个(CCND1、EGFR、IL1B、MMP2/9、PPARG等)。

子宫瘢痕妊娠是一种特殊类型的异位妊娠,指孕囊着床于既往剖宫产术后子宫下段瘢痕处。当前临床上关于子宫瘢痕妊娠的发病机制尚不明确,一般认为孕妇的前次剖宫产术导致子宫内膜缺损、肌层连续性被破坏,由此而出现的缝合错位、愈合不佳等情况使得子宫出现空洞或是缝隙,一旦受精卵和绒毛在此位置着床形成妊娠即为子宫瘢痕妊娠[4]。

2.5.2 药物-化合物-靶点-通路网络 利用Cytoscape软件导入苦黄颗粒组方药物、活性化合物、苦黄治疗NAFLD 105个重要靶点和KEGG通路富集分析TOP10，构建药物-化合物-靶点-通路网络(见图1)，图中可见一个化合物连接多个不同靶点和通路，提示苦黄颗粒是通过多靶点和多通路作用发挥治疗NAFLD作用。

阅读教学的简约化就是指阅读教学设计与实践的高度概括性，这种概括不是一般理解意义上的简单、空洞，而是以简洁、清晰、精炼、完美的外在形式具体地表达丰富的思想内涵。它不是教学环节在形式上的减少，也不是训练强度上的削弱，而是要固守语文教学的“根本”，尽量削去一些形式上的、不必要的、闲散的东西，最大限度的追求课堂教学的最优化，让学生进行有滋有味的语文实践活动，进入深入浅出思维的训练，获得简约深刻的语文感受。

2.6 苦黄对高脂饲料复合CCl

脂肪肝小鼠的体外实验

2.6.1 3组小鼠肝脏病理检测情况 见图2。肝组织HE染色结果显示：正常组小鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，形成肝板结构，细胞形态完整，未见坏死，胞核居中，无明显炎性细胞浸润。模型组小鼠肝板结构破坏，肝细胞疏松化、大泡样脂变、小泡样脂变及炎性细胞浸润。与模型组相比，苦黄组小鼠肝小叶结构破坏数目减少，肝细胞脂肪样变性及炎性细胞浸润减少。血清肝功能结果显示：与正常组相比，模型组小鼠肝功能ALT、AST明显升高，苦黄组小鼠ALT、AST明显下调(

<0.05)。

2.6.2 3组小鼠肝功能检测结果 见图3。

2.6.3 3组小鼠肝组织内TNFα、TLR4、Myd88表达情况 见图4。结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肝组织TNFα、TLR4与Myd88基因表达显著升高；给药后上述基因表达均显著下降。

在食品生产企业的卫生管理章节教学中，首先可通过课堂讲授让学生理解食品企业的SSOP，GMP和HACCP管理体系的建立。然后，抛出河豚毒素、贝类等中毒案例，引导学生设计符合HACCP的河豚、贝类等生产工艺。学生自行分组进行生产工艺的危害分析，并建立合适的关键控制点和关键限制，最后在课堂上全班共同讨论案例的卫生生产缺陷，并给出避免此类中毒案件的建议的卫生生产标准。

3 讨论

有研究表明，柴胡中的皂苷类能减少TC吸收、促进TC排泄，具有降低TG、TC水平作用；并能降低ALT、AST水平，减轻炎症反应，发挥护肝作用。黄酮类具有脂质调节功能，消除自由基发挥抗氧化作用

。大黄中的大黄酚、大黄酸等成分能够改善脂质调控基因PPAR、CPT-1的表达，改善NAFLD大鼠的ALT、AST、TG、TC和GLU的水平，发挥降脂作用

；同时，能够抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4表达，减轻炎症反应，改善NAFLD大鼠肝脏脂质滴空泡情况

。研究发现茵陈能够抑制LPS引起的巨噬细胞炎症，并具有降低肝内脂肪积蓄能力

；还能降低CCl

/EtOH致急性肝损伤动物的ALT、AST、TG水平及GSH、ADH、SOD和MDA水平，发挥降酶和抗氧化损伤的作用

；有研究表明茵陈色原酮能够改善肝损伤动物生化指标和病理特征

。苦参碱能够减轻NAFLD模型小鼠的肝脏病理损伤，减少肝细胞脂质滴并改善炎症细胞浸润，降低ALT、AST、TG水平，同时还能抑制脂质过氧化反应

。大青叶水煎剂能够促进小鼠淋巴细胞活性，增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并显示出抗氧化作用。

白色反光板顶端两黑色圆块形心间的距离通过游标卡尺设置为100.00 mm，在中心处设置同样大小的黑色圆块表示初始时刻激光照射在反光板上的图案。在中心黑色圆块附近布置一块同样大小的黑色圆块表示结构发生位移后激光照射在反射板上的图案。本次实验如图5所示，依次对10.00 mm、9.00 mm、6.00 mm和5.00 mm的4次不同位移距离进行测试。通过MATLAB软件对图像预处理并通过计算得到摄影测量结果和误差，如表1所示。

眼前的男人，一头白发，一脸皱纹。疲惫像刀一样，把这个比他高一个头的男人，削了一节。杨琳的病如一付重担，压在老钳工肩上，整个人仿佛都在往下沉。

2.2.2 单株干物质积累量 由图3看出，不同处理下冬小麦单株干物质积累随生育进程推进呈S型增长趋势，总体分3个阶段，返青至拔节期缓慢增长阶段，拔节至灌浆期快速增长阶段(其中抽穗至灌浆最快)，灌浆至成熟期缓慢增长阶段。早播条件下不同密度间的干物质积累量差异较大，晚播的不同密度处理间差异较小。同一密度下，单株干物质随播期的推迟而降低，分析原因是分蘖成穗的高低所致。

NAFLD靶点筛选结果提示，苦黄颗粒通过TNF、TLR通路以及IL-1β等靶点调控NAFLD过程中的炎症反应，调节脂质代谢可能是通过PPAR实现。

炎症因子失衡是NAFLD发生发展过程中重要的病理生理基础。Toll受体4通过一系列级联反应激活NF-κB，促进以TNF-α为代表的各类炎症因子大量释放，发生强烈的炎症反应，在 NAFLD 的发生发展中起着重要的作用。同时LPS可通过TLR4/MyD88信号途径活化枯否细胞，引发胰岛素抵抗。胰岛素的生理作用包括参与糖代谢及促进脂肪合成、抑制脂解，减少游离脂肪酸的释放。当机体存在有胰岛素抵抗时，胰岛素作用不足，脂肪分解增加，大量的游离脂肪酸(FFA)释放，肝内FFA氧化障碍使其利用减少。上述异常共同促使甘油三酯的形成增多，后者在肝细胞内的不断堆积导致NAFLD的发生。本研究结果提示苦黄颗粒可通过下调几种基因的表达对NAFLD的治疗起作用，这与网络药理学初挖的核心靶点与关键信号通路结果一致，为后续深入研究苦黄颗粒治疗NAFLD的作用机制提供部分参考依据。

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