致猪脑膜炎绿色气球菌的分离鉴定与16S rRNA基因序列遗传进化分析

蒋增海，孙 浩，谢静静，王紫晗，徐耀辉,2，何启盖

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046;3.华中农业大学 农业微生物国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

绿色气球菌(Aeroeoccusviridans)是第一个归属于气球菌属(Aeroeoccus)的一个种，为革兰阳性，兼性厌氧型，氧化酶和接触酶阴性的球菌[1]。该菌广泛分布在自然界中，存在于健康人体的上呼吸道及皮肤上，是医院的重要条件致病菌，在机体免疫力低下或免疫功能不健全时，可导致人发生败血症、菌血症、心内膜炎、尿道感染、脑膜炎以及关节炎等[2-4]。虽然绿色气球菌在国内外兽医领域研究较少，但是已有报道该菌与牛乳房炎相关，被认为是猪关节炎、肺炎、脑膜炎或者尿路感染的一种病原体[5-6]，且常常分离于鱼、虾、蟹等水产动物[3]。国内已有研究从仔猪心脏[7]、肺脏[7-9]、脾脏[10]、关节液[11]、肝脏[2]等分离到绿色气球菌，并进行了动物回归试验、药敏试验等，但是从脑部组织分离绿色气球菌研究较少[12]。

2020年11月中旬，天气突然降温，河南省豫西某规模化猪场饲养60～70日龄仔猪，猪群密度较大，在63日龄接种猪瘟弱毒疫苗后的第5天，出现4头仔猪猝死，于第7天，又发生3头仔猪死亡，濒临死亡前有划水样的神经症状，但体况良好，且这3头病死仔猪中，有2头病死仔猪的关节还表现为肿大。为了确定这些致脑炎死亡仔猪的病因，从3头病死仔猪体内，无菌采集病料，进行细菌分离鉴定并开展本研究。

1 材料与方法

1.1 病料来源病料为送检3头病死仔猪的脑部组织，以及其中2头病死仔猪肿大的关节组织。

1.2 主要试剂胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)购自美国BD公司；犊牛血清购自杭州四季青生物有限公司；哥伦比亚血琼脂平板购自江门市凯林贸易有限公司；Ex Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、10 × Ex Taq Buffer(Mg2+plus)购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker购自北京博迈德基因技术有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；生化试验试剂反应管购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离培养从送检3头病死仔猪，无菌采集脑组织、关节液，分别接种于哥伦比亚血琼脂平板，37℃培养18～24 h， 选择形态大小均匀一致的优势菌落，进一步接种哥伦比亚血琼脂平板、TSA平板(添加5%犊牛血清)进行纯化、传代，挑取单菌落，接种于TSB肉汤(添加5%犊牛血清)，37℃培养18～24 h，-80℃保存备用。

1.4 染色镜检从纯化培养的血琼脂平板中，挑取单菌落，进行革兰染色后，油镜下，观察纯培养物的形态特征。

1.5 生化试验从分离纯化的血琼脂平板中，挑取单菌落，接种于TSB肉汤中，37℃培养16～18 h,取少量菌液接种于微量生化反应管，37℃培养24～96 h，观察并记录结果。

1.6 16S rRNA基因序列测定与遗传进化分析通过水煮法提取细菌DNA模板，利用16S rRNA通用引物(16S-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S-1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTA-CGACTT-3′)，进行16S rRNA基因序列的PCR扩增，将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。首先通过BLAST，将测序结果与GenBank数据库中已有的基因序列进行同源性比对，进行分离菌株鉴定。其次，使用DNAStar.Lasergene.v7.1和MEGA 5.05软件，将测序结果与从GenBank数据库中获取相近的基因序列进行比对(表1)，构建系统发育树。

表1 各种绿色气球菌参考菌株的信息

1.7 药敏试验根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐K-B纸片扩散法适当修改，进行操作和结果判定[13-14]。挑取生长良好的绿色气球菌单菌落，接种于TSB肉汤(5%犊牛血清)，37℃培养24 h 后，再将菌液稀释为0.5麦氏浊度，使用灭菌棉签，蘸取菌液均匀涂布于哥伦比亚血琼脂平板，贴上药物纸片，37℃培养18～24 h,测定各种药敏片抑菌圈，根据抑菌圈测量结果，进行药物敏感性判定[13-14]。

2 结果

2.1 病猪的主要病理变化送检3头仔猪，打开颅骨后，可见脑膜出血，血管怒张明显，但是出血严重程度有一定差异(图1)；其中2头仔猪，存在膝关节肿大，切开关节，可见关节液增多。

图1 剖检3头仔猪脑膜出血、血管怒张

2.2 细菌的分离培养特征采集病死仔猪脑组织、关节炎5份病料，分别接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，纯化、传代，并接种于TSA(添加5%犊牛血清)平板培养，结果表明，共分离到5株细菌，分别命名为P1、P2、P3、T1和T2(P代表分离于脑，T代表分离于膝关节；其中P1、T1分别分离于同1头猪的脑和关节，P2和T2分别分离于另外1头猪的脑和关节，P3分离于第3头猪的脑部)。分离菌株在血琼脂平板上生长呈灰白色、圆形，大小为1.4～1.5 mm 的小菌落，呈草绿色的α溶血环(图2)，相比猪链球菌菌落的α溶血环更大，溶血程度更明显；分离菌株在TSA(添加5%犊牛血清)生长良好，菌落呈淡白色、圆形，大小为1.0～1.5 mm,不透明。

A.正面；B.反面

2.3 染色镜检特征分离菌株通过革兰染色，油镜下观察，呈革兰阳性，单个、双联或者四联的球菌(图3)。

图3 分离菌株革兰染色结果(×1 000)

2.4 生化试验将5株疑似分离菌株分别接种进行生化反应鉴定，结果表明分离菌株接触酶试验、氧化酶试验均为阴性，能发酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蕈糖，不能发酵棉籽糖、山梨醇、密二糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖；M.R.试验为阳性，硫化氢试验、硝酸盐还原试验、V-P试验结果为阴性，不能与马尿酸、尿素、七叶苷发生反应，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验为阴性；不能利用枸橼酸盐。根据生化试验结果，将分离菌株鉴定为绿色气球菌。

2.5 16S rRNA基因的PCR扩增利用分离菌株提取的细菌DNA为模板，进行16S rRNA基因的PCR扩增，其扩增产物经过1%琼脂凝胶电泳检测，在1 000～2 000 bp可见1条约1 500 bp清晰的目的条带(图4)，表明扩增的目的条带与预期扩增结果大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.分离菌株；6.去离子水

2.6 16S rRNA基因序列测定与遗传进化分析5株分离细菌的16S rRNA基因序列的测序结果，通过BLAST与GenBank数据库中已有的基因序列进行同源性比对，结果表明,与GenBank数据库中已发表的绿色气球菌菌株同源性在99%以上,进一步表明5株分离细菌均为绿色气球菌。

利用DNAStar、Lasergene.v7.1软件，将测序结果与从GenBank数据库中获取相近的基因序列进行比对，构建系统发育树，结果表明分离菌株P1、T1、T2和P2单独构成一个独立分支，与分离菌株P3亲缘关系较远，然而分离菌株P3与2017年中国山东分离于植物根围的FL09菌株、2017年印度分离于新生儿血液样品的SNSK 102菌株亲缘关系最近，与2009年中国广东分离于关节炎的GDQY-1、2018中国吉林分离于脑膜炎的AV-X1、2019年中国河北分离于关节液的HDS1等比其他4株绿色气球菌分离菌株的亲缘关系更近；5株绿色气球菌分离菌株均与2019年法国分离于皮肤的1菌株亲缘关系最远(图5)。

图5 分离菌株16S rRNA基因序列遗传进化关系

2.7 药敏试验结果由于目前还没有建立起绿色气球菌药敏试验的解释标准，本试验根据CLSI公布的链球菌、葡萄球菌等细菌药敏试验的解释标准进行判定，研究结果表明，分离菌株对复方新诺明(磺胺类药物)、四环素、头孢曲松耐药率均为100%(5/5),对氧氟沙星、头孢噻肟、红霉素耐药率为80%(4/5)，对氯霉素、环丙沙星等敏感率相对较高，对其他药物敏感性不等(表2)。

表2 分离菌株的药敏试验结果

3 讨论

绿色气球菌现已经被报道作为人和动物的病原菌，但是正常情况下，在临床诊断过程中，绿色气球菌不是调查的病原菌，通常被误诊为其他病原菌[3]，因此绿色气球菌对人和动物的致病性，没有得到足够重视。绿色气球菌作为机会病原菌，在机体抵抗力下降情况，更容易导致感染，经常与其他病原菌如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)等混合感染[2-3,9]。PAN等[15]报道猪链球菌和绿色气球菌混合感染，引起了仔猪急性脑炎，与本研究第3头仔猪感染情况一致(从第3头仔猪的脑部不仅分离到绿色球菌P3，又分离到猪链球菌，文中没有显示该数据)。本研究从接种过猪瘟弱毒疫苗后第7天，发生脑膜炎致死的仔猪脑部和膝关节中分离到了绿色气球菌，表明绿色气球菌与猪链球菌一样，可以单独或者两者一起引起仔猪感染，发生脑膜炎、关节炎，造成死亡，应引起重视。

本研究中，分离菌株16S rRNA 基因序列，通过BlAST同源性比对，表明与绿色气球菌的同源性最高，为99%以上，进一步证明分离菌株均为绿色气球菌。16S rRNA基因序列遗传进化分析表明，分离菌株P1、T1、T2和P2处于同一分支，与分离菌株P3亲缘关系较远，然而分离菌株P3与2017年中国山东分离于植物根围的FL09菌株、2017年印度分离于新生儿血液样品的SNSK 102菌株亲缘关系最近，这说明了分离菌株P3与不同物种及地域和时间上分离的菌株差异性小，而与在同一物种同一地域分离的菌株P1、T1、T2和P2则存在一定的差异性，与张乐宜等[7]报道结果一致。

目前，虽然还没有建立起对于绿色气球菌药敏试验的折点解释标准，但是国内外学者都对绿色气球菌耐药情况进行调查研究[3,5，8-11]。MORENO等[5]研究表明对于从猪尿道感染分离到的绿色气球菌，头孢噻呋、氟喹诺酮类和氨基糖苷类等药物的最低抑菌浓度显示变异很大，磺胺类、四环素类、大环内脂类、卡那霉素等药物显示最高的最低抑菌浓度，表明可能耐药。本研究中，分离菌株对复方新诺明、四环素均耐药，其中4株分离菌株对红霉素耐药，其中3株分离菌对卡那霉素耐药，与上述报道基本一致；分离菌株对头孢噻呋均耐药，与林华等[2]报道绿色气球菌对β-内酰胺类药物有较好的敏感性不同；分离菌株对氯霉素、环丙沙星等相对敏感，与董文龙等[8]报道结果基本一致。虽然，分离菌株P1、T1或者P2、T2分别分离于同1头病猪的2个不同部分，但是其药敏试验结果也有差异。根据药敏试验结果，可以选择环丙沙星，或者氯霉素同类药物氟苯尼考作为本次绿色气球菌感染的治疗药物。

本研究结果显示虽然分离菌株来源于同一个猪场的同一次疫情暴发，甚至来源于同一头病猪的不同部位，但是分离菌株16S rRNA基因遗传进化关系距离较远，以及耐药性存在显著差异，表明这些绿色气球菌分离菌株可能不是来源于同一个菌株的克隆子，存在巨大遗传多样性，与MARTN等[6]报道来源于同一猪群的不同病猪的绿色气球菌存在巨大遗传多样性的结果一致。进一步说明绿色气球菌是一种机会病原菌，在同一猪场中存在遗传多样性的不同菌株，当猪群暴露于环境中的多种绿色气球菌菌株条件下，天气突变、 群体密度过大、免疫接种抓捕等,作为重要诱因，能够引起不同仔猪发病，而不是由1头仔猪感染绿色气球菌后，排出病菌，再次传染给其他仔猪的流行情况。