CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肉牛基因组编辑中的应用

朱进华，翟亚莹，朱肖亭，于 翔，李玉龙2,，张志杰，张格阳2,，张子敬，吕世杰，施巧婷，陈付英，徐照学，王二耀*

(1.河南省动物卫生监督所，郑州 450003；2. 河南农业大学动物科技学院， 郑州 450002；3. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所， 郑州 450002)

在传统方法(ZFNs技术和TALENs技术)中，外源序列被随机整合到动物基因组中，具有随机性和不确定性，编辑效率低且成本较高。CRISPR/Cas9技术与传统方法截然不同，基因组可以以单核苷酸的精度进行工程改造，使基因更精确地定点编辑[1]。

对于我国的肉牛种业品种改良进展慢、育种成本高，这是限制其良种培育的“卡脖子”问题[2]。CRISPR/Cas9技术的产生与应用在改良肉牛遗传育种上，提供了一种更加高效价廉的方法，对肉牛育种和疾病防控等产生了巨大和深远的影响。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展历程、作用机制、生产应用方面进行综述，重点介绍该系统在肉牛研究中已取得的最新进展，并对其发展做出展望。

1 CRISPR/Cas9的发展历程

早在1987年，Ishino[3]在研究大肠杆菌的IAQ基因时，发现IAQ基因的编码区下游有一段串联间隔的重复序列，被含32个碱基的序列隔开，但此发现在当时并没有引发太大关注。后来科研人员在细菌及古细菌中都检测到了CRISPRS[4]，并预测了它们在基因修复或调控中发挥的作用[5-6]，Jansen博士领导的实验室发现了4个与CRISPR相关的基因—CAS基因[7]，这些基因始终位于CRISPR基因座上。后来人们发现这些短而独特的序列与病毒或质粒的DNA序列相匹配，这暗示着CRISPR-Cas系统的“适应性”，其能提供针对入侵者的特异性防御[8]。随后的生信分析[9]验证了这一点， 而后CRISPR 的作用机制首次在葡萄球菌干扰试验中得到验证[10]。CRISPR-Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种类型[11-12]，张锋课题组[13]设计了两种不同的Ⅱ型CRISPR / Cas系统，证明了Cas9核酸酶通过介导短RNA(sgRNA)可以定向诱导内源性基因组位点裂解。Cas 9还可以转化为一个缺口酶，促进具有最小诱变活性的同源定向修复。另外，多个sgRNA序列可以共同编码成一个CRISPR阵列，同时编辑基因的多个位点，这表明CRISPR —Cas系统具有易编辑性和广泛适用性。

2 CRISPR/Cas9的作用机制

CRISPR/Cas9的作用机制可以分为以下三个阶段：间隔区的获得、CRISPR的表达、外源DNA的切割。第一步：间隔区的获得，当噬菌体侵入细菌时，CRISPR系统会捕获一段被称为原型间隔序列的外源DNA序列，通过 Cas1、Cas2 和 Csn2 整合到 CRISPR 阵列中，当噬菌体再次入侵时，该“记忆”区间能起到自动识别的作用CRISPR系统将该序列插入到前导序列与间隔重复序列之间[14]。第二步：CRISPR的表达，新形成的间隔区与其他所有间隔区，共同转录成一个包含间隔区和重复序列的CRISPR RNA( pre-crRNA) ，进一步被切割成较小的crRNA，同时合成Cas9蛋白。第三步：crRNA和cas9蛋白在track RNA的指导下形成和蛋白复合物并进行定点切割外来序列，破坏外源DNA[15](如图1)。

CRISPR/Cas9的结构之一—Cas9是一种内切核酸酶，它使用RNA双链体(TracRNA:CrRNA)中的导向序列与DNA靶序列形成碱基对，使Cas9能够在DNA中引入位点特异性双链断裂。在实验室试验中，双重tracrRNA:crRNA被设计成一个单一的导向RNA (sgRNA )，它保留了两个关键特征:在5′的序列通过沃森-克里克碱基配对确定DNA靶位点，在3′的双链RNA结构结合Cas9。sgRNA指导Cas9的导向序列发生变化，以靶向任何感兴趣的DNA序列[16]，从而进行定点切割。DNA双链切断后，细胞启动自我修复机制，利用非同源末端连接修复(NHEJ)和同源重组修复(HDR)两种方式对基因进行修复。此环节科研人员可插入外源基因，实现基因的同源重组[17](如图2)。

图1 CRISPR/Cas9系统的防御机制[2]

图2 CRISPR/Cas9的作用机理[2]

3 CRISPR/Cas9技术在肉牛上的应用

牛的生产周期长，实验成本高，所以CRISPR/Cas9技术在牛上的应用比较少，较其他动物而言发展较慢，在2014年才出现第一个由CRISPR/Cas9介导、围绕牛开展的基因编辑试验[18]，该试验表明CRISPR/Cas9技术可以高效地编辑牛胚胎和诱导多能干细胞。近些年对于肉牛的基因编辑研究有所增加，CRISPR/Cas9技术的发现和应用对于提高肉牛抗病性、改善产肉性能、优化繁殖性状等方面均有显著影响。

3.1 应用于提高牛抗病性

肉牛的健康状况直接影响着肉牛产业的发展，CRISPR/Cas9技术可以通过定点敲入或敲除基因，培育出具有抗病能力的牛。日本黑牛肉质鲜美以大理石花纹闻名，95%的日本黑牛是通过人工授精繁育，所以当优秀的公牛携带的疾病时，可通过人工授精广泛传播。其中IARS综合征是存在于日本黑牛中隐性疾病的一种，其发病原因是IARS基因突变为纯合子，患病纯合突变的犊牛在宫内生长迟缓，体质虚弱，死亡率高甚至宫内死亡。为修正突变的密码子，日本科学家利用CRISPR/Cas9技术，将CRISPR/Cas9和包含正确氨基酸的同义密码子的供体DNA，引入从纯合突变小牛分离的胎牛成纤维细胞(BFF)细胞中，后进行细胞核移植得到了SCNT胚胎，最后成功得到的IARS基因被正确修复的胎牛[19]。

地方上传染病对于当地牛业发展而言是很大的威胁，其中牛白血病病毒(BLV)导致的地方性传染病是一种可以在人和牛间广泛传播的慢性传染病，其防治对于人畜安全生产都很重要。有研究表明，CD209分子可能是BLV的潜在受体，目前已在实验室水平研究出用于敲除CD209基因的CRISPR/Cas9系统，有望通过基因编辑生产出对BLV感染具有抵抗力的牛[20]。

在牛生产上，腹泻一直是严重影响犊牛、成牛健康状况的重要疾病，病原之一的牛病毒性腹泻病毒(BVDV，以下简称BVDV)可导致牛病毒性腹泻病 (BVD)，该病在牛之间具有高度接触传染性[21]。牛感染该病毒后轻则出现精神沉郁，腹泻发热，胎牛流产等症状，重则直接死亡；对育肥牛的产肉率，奶牛的奶产量，种用牛的繁殖力有一定影响，并且继发持续感染[22]。为从基因水平上探究防治 BVDV 的方法，有研究利用CRISPR/Cas9系统，分别敲除了牛肾上皮(MDBK，以下简称MDBK) 细胞的低密度脂蛋白受体(LDLR) 基因[23]和MDBK细胞的SERPINF2基因[24]，结果发现分别敲除这两个基因均能显著性抑制BVDV复制，这为生产抗腹泻病毒的牛提供了试验依据。

另外，CRISPR/Cas9 系统还可以用于疫苗的研发，CRISPR/Cas9 系统成功敲除了牛疱疹病毒( BHV) 的gE基因，使牛疱疹病毒灭活且重组毒株具有免疫原性，为疫苗生产的新方式提供了试验基础[25]。

3.2 应用于提高产肉性能

MSTN已被证明跟肌肉的发育有关，MSTN的存在会抑制肌肉发育[26-28]。郭梓茹[29]利用CRISPR/Cas9技术构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系，得到MSTN基因敲除的细胞株，该细胞株可作为供体细胞，利用体细胞核移植技术生产MSTN基因敲除的蒙古牛。后尉翔栋[30]利用CRISPR/Cas9技术成功制备了敲除MSTN基因的牛胚胎，丰富了双肌肉牛品种培育的遗传素材。目前敲除MSTN基因的转基因牛已被生产出来，李广鹏[31]等利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以影响肌肉发育的MSTN基因为靶标,选择不同位点进行定点敲除,经体细胞克隆技术得到了基因编辑牛，再利用编辑牛精液分别与鲁西牛、蒙古牛和西门塔尔牛配种,生产了221头F1代，对F1代进行生化血液分析和屠宰性状分析，结果显示MSTN基因编辑牛的各项体尺指标普遍优于普通牛,后躯发育极显著提升,产肉率提高且肉质正常。胎儿发育正常,出生体重正常,无明显难产现象[32-33]。

除MSTN可以影响牛的肌肉发育外，肌细胞生成素(MyoG)、生肌因子6(Myf6)在肌纤维数量的固定、肌纤维类型的分化过程中也起到了重要作用[34]。李冬晓[35]以牛骨骼肌卫星细胞为试验材料，利用 CRISPR 干扰( CRISPRi) 技术同时和分别干扰MyoG、Myf6基因的表达，以探究MyoG、Myf6 基因的低表达时对肌肉分化的影响。另外，IGF2基因也已被证实与肌肉发育有关，以浓度控制的方式促进肌纤维的分化[36]，浓度高时促进肌肉生长发育，反之抑制[37]。CRISPR/Cas9系统可以有效编辑IGF2基因并提高其表达水平,在得到IGF2基因编辑牛胚胎后，通过胚胎移植技术得到高产肉牛，这会成为分子育种的又一突破[38]。

3.3 应用于提高繁殖率

牛繁殖率低是困扰养牛产业发展的瓶颈问题之一，科研人员利用CRISPR/Cas9技术不断探索，尝试找到提升牛繁殖性能的方法。BMP15和GDF9基因在牛的卵泡发育上起到调控作用[39-41]，其突变可以促进卵泡发育并提高排卵率[42]。冯万有[43]使用CRISPR/Cas 9技术突变对水牛胎儿成纤维细胞上的BMP15和GDF9 基因同时进行基因敲除，其中BMP敲除效率为37.5%，GDF 敲除效率为10.0%，此试验为CRISPR/Cas 9双基因同时编辑提供了试验基础，旨在探究提高水牛繁殖能力的分子育种方法。另有研究表明，利用CRISPR/Cas 9系统对牛胚胎的NONAG基因进行定点敲除后，滋养层(TE)的分离和维持没有明显变化，但可以影响多能内细胞团(ICM)结的分化与增殖[44]。利用CRISPR/Cas9技术建立肉牛的繁育体系已经被提上日程，中科院西北高原生物研究所[45]将此技术应用在牦牛品种改良，提供了一套切实可行的牦牛体外胚胎生产和基因编辑技术体系，以促进牦牛的优繁优育和阔群增量。

由于繁殖性状受环境因素、人为因素的影响较大，主效基因复杂，目前利用CRISPR/Cas9对于繁殖性状进行改良的研究比较少，但随着CRISPR/Cas9技术的不断进步和人们对基因的深入探索，相信该技术未来一定可以为肉牛种业的兴旺发达做出贡献。

4 展望

农业现代化，种子是基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术的产生对于我国肉牛种业振而言有很大的促进意义，科研工作者们有了更高效精确的工具来编辑基因。然而该技术还存在一些问题，如体系不稳定、脱靶率较高等，需要进一步改善优化。目前CRISPR/Cas9技术在人、小鼠、斑马鱼等方面都有了长足进步，该技术在肉牛上的实验室研究也在如火如荼地进行着，接下来需要理论与实践相结合，把科研成果落实在生产上，相信未来我国的肉牛产业将会拥有更加广阔的发展前景。