基于网络药理学及分子对接技术探讨中药治疗脑卒中作用机制的研究进展

刘玥彤，蒙兰青2，刘佩，杨鎏鑫，刘蕾3，欧阳扬，黄清2，陈维，陈玉珍，方子文

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；3. 广东省粤北人民医院，广东 韶关 512000)

脑卒中在中医被称为中风，以突然昏仆、半身不遂、肢体麻木、舌蹇不语、口舌歪斜、偏身麻木等为主要表现的脑神经系统疾病。中药是中华民族的瑰宝，几千年来在脑卒中治疗中积累了丰富的临床经验，由于缺乏对其作用机制的科学阐释，影响了中药在脑卒中治疗中的应用。应用现代技术分析和阐释中药在治疗脑卒中的作用机制，是目前中医药学者研究的焦点[1]。

网络药理学是一门以系统生物学、生物信息学和通量组织学为基础的全新学科，将中药与网络药理学相结合，建立了一种新的研究方法——中药网络药理学，解释药物-基因-疾病三者之间的关系[2]。分子对接是一种研究小分子配体与蛋白质受体之间相互作用和识别的理论方法。将网络药理学和分子对接技术相结合共同研究中药治疗脑卒中，为活性成分筛选和机制探索提供新的方法[3-4]。本文将网络药理学及分子对接技术探讨中药在治疗脑卒中作用机制。

1 中药网络药理学及分子对接技术

1.1中药网络药理学 自从英国药理学家Hopkins于2007年提出“网络药理学”概念后，中医药研究工作者在多学科理论基础上，通过可视化软件构建“中药、成分、靶点、疾病”相互作用网络，评估药物的有效性、作用机制以发现高效低毒的药物[5-6]。我国学者李梢[7-8]于2002年首次提出通过生物信息学分析复杂系统，从“关系→网络→功能”角度探讨中药对疾病的干预作用。以“网络”为核心，利用公共数据库和生物信息学技术对药物成分的靶点信息和特定疾病的靶点信息进行筛选，通过Venny等平台进行映射取交集得到交叉靶点，即该药治疗疾病的潜在作用靶点[9]。然后构建“药物-基因-靶点-疾病”互作网络，以网络靶标为切入点，探讨药物对“致病网络”的作用机制并对药物 防治疾病的潜在作用靶点、参与调控的信号通路及中药复方制剂配伍规律进行预测[10-11]。最后以实验数据支撑，揭示中药的现代药理学机制。朱德才等[12]对丹参治疗缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)潜在效应机制进行研究，通过网络药理学发现丹参中有效成分38种，丹参治疗缺血性脑卒中的核心靶标83个，后通过GO和KEGG富集分析，发现丹参中的丹参素、丹参酚等化合物可通过调节卒中后侧支动脉的直径、抗血小板凝聚、抗氧化等诸多作用治疗CIS。川芎嗪是中药川芎中所含的有效成分之一，常用来治疗缺血性脑卒中、冠心病等相关的多种疾病，基于中药网络药理学的方法，构建化学成分和疾病相关蛋白网络，网络中包含150个作用靶点和410个与缺血性脑卒中相关的靶标，分析提示川芎嗪可以调节凝血系统、纤溶系统、炎症、血小板功能、血管功能等生物过程方面及调控补体和凝血级联、钙信号通路、血小板活化、神经活性配体-受体相互作用等信号通路发挥活血化瘀作用[13]。

常用的网络药理学数据库主要药物分子数据库、靶点数据库、蛋白质相互作用数据库、蛋白质晶体结构数据库及通路数据库等，见表1，基于以上数据库可筛选药物有效成分及网络可视化分析[14-15]。

表1 常用的网络药理学数据库及特点

1.2分子对接技术 分子对接技术(molecular docking)是从100年前Fischer E等[18]提出的“锁钥模型”到二十世纪中叶Koshland DE[19]提出的“诱导契合理论”的基础上发展而来，利用配体与受体相结合的理论，从刚性对接、半柔性对接到柔性对接，逐步阐明配体与受体的结合是一个动态过程，即配体与受体诱导契合过程中发生构象改变，最终形成形状和能量最优匹配的结合模式。

分子对接的3种方法中，刚性对接适合考察比较大的体系，比如蛋白质和蛋白质、蛋白质和核酸之间的相互作用，计算和原理相对简单，主要考虑构象之间的契合程度。半柔性对接适合于处理小分子和大分子之间的对接。在对接过程中，小分子相对较小，其构象一般是可以变化的，因此在考察柔性的基础上，还可以保持较高的计算效率。柔性对接适合于精确考察分子之间的识别情况，在提高了对接准确性的同时也耗费较长的计算时间。

分子对接技术在药物设计领域广受欢迎，它既可以用来预测结合模式，还可以用来预测结合亲合力。在过去的20年中涌现出了大量的分子对接软件比如AutoDock、AutoDock Vina、LeDock、rDock、Flex X、UCSF DOCK、LigandFit、GLIDE、GOLD、MOE Dock、Surflex等，在小分子配体-蛋白质分子对接、蛋白质-蛋白质分子对接、蛋白质-DNA分子对接、蛋白质-RNA 分子对接中发挥重要作用[20-21]。常用的分子对接软件及其特点见表2。

表2 常用的分子对接软件及特点

1.3网络药理学及分子对接技术在探讨中药作用机制的路线分析 从TCMSP等数据库中筛选出药物有效成分及靶点信息；从CTD等数据库中筛选出疾病相关靶点；将药物靶点信息与疾病靶点信息取交集并进行分子对接，最后利用交集基因作GO和KEGG富集分析等来研究中药治疗疾病的作用机制。见图1。

图1 网络药理学及分子对接技术在

2 运用网络药理学及分子对接方法研究中药治疗脑卒中作用机制

2.1中药治疗缺血性脑卒中的作用机制研究 脑卒中已成为世界上仅次于冠心病和癌症的第三大常见死因[22]，其中缺血性脑卒中(CIS)占所有卒中的70%～80%，是临床最常见的卒中类型[23]。目前，溶栓已被认为是CIS最快、最有效的治疗方法，但由于适应证严格、时间窗短、出血风险高、再灌注损伤等原因，溶栓治疗的临床效果有限[24]。大量的实验研究和临床观察证实，中医药在治疗CIS方面具有独特的优势，具有一定神经保护作用[25]。向净匀等[26]利用网络药理学和分子对接技术，研究黄芩素(BE)、京尼平(GE)抗脑缺血的作用机制，发现以SE(灯盏花乙素苷元：对阻塞大脑中动脉所致的缺血性脑卒中动物模型发挥神经保护作用)作为参照预测BE、GE抗脑缺血疾病靶点有 PIK3CG、CYP1A2、VEGFA、ALOX5、PTGS2，BE与GE配伍治疗缺血性脑卒中主要通过抑制PTGS2(COX-2)的表达，减轻炎症因子造成的脑组织损伤，改善血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性发挥脑保护作用。吴京霓等[27]在网络药理学及分子对接技术基础上加用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)研究醒脑静注射液入脑成分及其治疗脑缺血损伤的作用机制，发现龙脑、麝香酮、樟脑、莪术二酮等13种醒脑静注射液入脑成分和93个醒脑静注射液治疗脑缺血的作用靶点，这些靶点主要通过神经营养蛋白信号通路、雌激素信号通路及血管内皮生长因子信号通路等发挥抗脑缺血损伤，并验证了栀子苷、莪术二酮、麝香酮等代表性成分与治疗脑缺血潜在靶点具有较好的亲和力。黄清等[28]通过筛选神经血管单元差异基因与“缺血性脑卒中”靶点取交集，结果得出缺血性脑卒中神经血管单元靶标，相关的神经血管单元靶标236个，其中VEGFA、IL-6等为关键靶标，通过GO和KEGG分析得出神经血管单元的缺血性脑卒中相关靶标能通过PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路等多种生物过程、多个通路发挥抗脑缺血作用。马岱朝等[29]报道了丹参多酚酸(SA)治疗脑梗死的作用机制，从数据库中筛选得到305个靶点蛋白，再与脑梗死相关靶点取交集得到335个交集基因，通过GO和KEGG富集分析得出SA可能具有激活PPAR信号通路，并拮抗FABP4发挥神经保护作用。同时SA可能作用于IL-17 信号通路而保护血脑屏障，并可能促进IL-4合成从而达到抗炎作用，诠释了中药中多成分、多靶点作用机制。贾彩霞等[30]提出了大黄素对缺血性卒中干预机制的研究思路，即通过网络药理学方法构建大黄素的“脑缺血中风-证候-靶点-成分”网络，对大黄素的靶标谱与病证分子网络中的关键模块进行网络分析，揭示大黄素可能主要通过CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9作用于细胞凋亡通路及炎症通路等发挥治疗脑缺血中风的作用。

2.2中药在出血性脑卒中作用机制研究 出血性脑卒中包括高血压脑出血(ICH)、脑动脉瘤破裂出血、脑动静脉畸形出血、蛛网膜下腔出血(SAH)等。其发病往往都有诱发因素，如情绪激动、睡眠不好、用力过度、便秘、排尿困难等。由于出血性卒中的高死亡率及预后差等因素，使得越来越多的学者探讨能有效治疗出血性卒中的方法。系统评价表明，中草药(CHM)辅助治疗不仅在缺血性脑卒中发挥重要作用，还可改善出血性脑卒中患者的神经功能缺损、血肿体积及血肿周围水肿体积，并且具有良好的安全性[31]。将网络药理学等相关组学技术用于探讨CHM在出血性卒中的作用机制，以期探索疾病与药物更深层次的关联。Zhang B等[32]发现苗药血脉通胶囊对ICH周围缺血区继发性脑损伤有保护作用，血脉通胶囊(XMT)是已应用于临床的一种中药，通过使用网络药理学、聚类分析和富集分析筛选了XMT靶标、化合物成分和ICH相关靶标，发现肿瘤坏死因子(TNF)信号通路可能是XMT治疗ICH的关键信号通路。其次，XMT可通过调节TNF受体1(TNFR1)/CASP3抑制缺血区神经元凋亡、通过调节TNFR1/核因子κB和TNFR1/MAPK信号通路缓解炎症和水肿及通过介导TNFR1/MAPK/END1减轻脑缺血区的低灌注。SAH是一种破坏性的中风亚型，死亡率及发病率很高，即使患者在最初的出血紧急情况下幸存下来，迟发性脑缺血(DCI)也常在2周内发生，并造成额外的严重脑损伤。张友刚等[33]基于网络药理学研究脑血疏口服液治疗脑出血的作用机制，通过建立单味药-成分-靶点、交集基因蛋白质相互作用及活性成分-靶点-通路网络模型，筛选出脑血疏口服液治疗脑出血的活性成分56种、靶标40个及相关通路20条，其中黄芪紫檀烷苷、槲皮素、汉黄芩素、川芎嗪、桉脂素等可能是重要物质基础，ESR1、AKT1、PIK3CA、AKT3等靶点和PI3K-Akt、肿瘤坏死因子、细胞凋亡等信号通路在治疗脑出血过程中起着关键作用。刘辉等[34]通过Genecards数据库、OMIM、TTD、Pharm GKB数据库和Cytoscape软件构建了苏合香丸的分子靶标与SAH生物分子网络的关联机制；通过苏合香丸活性成分-SAH靶点网络进行网络拓扑参数分析，筛选出与疾病网络联系度最高的节点；相关文献的体内和体外实验验证，最终得出苏合香丸有效成分可通过与SAH后一氧化氮合酶(NOS)结合减少NO的产生，降低认知功能障碍的发生；同时与儿茶酚胺及其受体的结合而有效发挥“醒脑开窍”的作用。

3 结语

越来越多的科研工作者采用组学间联合的方法进行药物靶点及作用机制研究，如上述学者在网络药理学的基础上联合分子对接技术得出中药及其复方制剂的有效成分及其作用靶点，基于“药物-靶点-基因-疾病”网络构建、可视化分析及相关疾病靶蛋白的构建，初步阐明了中药治疗脑卒中的作用机制，验证中药药效的微观生物学基础，优化和评价已知中药(复方)的临床疗效。目前还有少数学者采用的细胞及动物实验对网络药理学及分子对接结果进行验证，在一定程度上验证了该法的可行性及可靠性，李文标等[35]采用了Western blot方法验证炙黄芪拮抗阿霉素心肌损伤作用机制，发现炙黄芪可通过抑制JNK/c-Jun/c-Fos通路进而减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡，从而拮抗阿霉素造成的心肌损伤。

网络药理学和分子对接技术的迅速发展体现了现代生物医药模式的转变，但也面临诸多挑战，如中药及其复方制剂中成分多，筛选困难，数据库中的关键靶点及药效成分作用机制不明确，现有的分子对接软件程序复杂，分子对接的评价方法不完善等。虽然通过网络药理学和分子对接技术探讨了中药在脑卒中作用机制，但实验验证相关报道较少，仍需大量的体内、体外实验加以阐释。