盐碱胁迫对中华绒鳌蟹毒性作用研究

杨雨虹，李明帅,，罗 亮，王世会，张 瑞，郭 坤，刘金雨,3，李海涛,3，赵志刚*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室，哈尔滨 150070；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 200090）

我国盐碱水资源丰富，但却不能为人畜饮用，也无法直接运用于农业生产中。通过渔业手段有效开发和利用盐碱水域资源，对拓展水产养殖空间、保障水产品供给、实现盐碱环境生态修复具有重要意义[1]。

农业农村部已将盐碱水养殖作为十大模式之一，列入《2020年水产生态健康养殖模式示范行动方案》[2]。盐度和碱度作为盐碱水养殖过程中重要水质参数，显著影响水产动物生长发育、生理代谢、组织功能等方面[2-3]。水生动物盐碱耐受性是遗传因素和环境长期共同作用结果。开展水生动物盐碱耐受能力研究，对揭示其耐盐碱机制、开发耐盐碱水产养殖品种具有重要意义。目前，研究人员对鲫（Carassius auratus）[4]、罗氏沼虾（Macrobrochium rosenbergii）[5]、凡 纳 滨 对 虾（Litopenaeus vannamei）[6]、大鳞鲃（Barbus capito）[7]等养殖品种盐碱耐受能力开展相关研究。

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）属十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、绒螯蟹属，俗称河蟹，味道鲜美，营养价值高，是我国重要经济水产动物。自然条件下，中华绒螯蟹生活史较为复杂，幼蟹和成体主要生长在淡水中，而亲本繁殖行为及幼体发育均需在半咸水中完成[8]。研究表明，盐度变化可显著影响中华绒螯蟹摄食生长、性腺发育、繁殖行为、组织生理、能量代谢、机体免疫等[9-11]。目前，关于碱度及盐碱交互胁迫对中华绒螯蟹相关方面研究极少。本研究通过测定中华绒螯蟹对氯化钠盐度、碳酸氢钠碱度以及盐碱交互作用耐受能力，探究中华绒螯蟹对盐碱水域环境生理耐受性，为中华绒螯蟹盐碱水养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用蟹为中华绒螯蟹，来自辽宁盘锦。挑选体质健壮、规格整齐、附肢完整幼蟹用于试验，平均体质量为（8.33±1.76）g，平均体宽为（25.6±2.1）mm，平均体长为（24.7±1.8）mm。试验开始前在玻璃水箱中暂养15 d，暂养期间每日定量投喂，持续充氧，每日换水1/3。试验开始前停饲24 h。

1.2 试验用水配制方法

试验用水为充分曝气的自来水，每个试验处理用水均为10 L。盐度和碱度分别采用分析纯氯化钠（NaCl）和碳酸氢钠（NaHCO3）配制。配制时将氯化钠和碳酸氢钠按所需量准确称量加入自来水中，试剂溶解后充分混匀，静置稳定24 h后测定，水体盐度通过盐度计测定，碱度采用盐酸甲基橙标定法测定。

1.3 方法

正式试验前预试验，获得中华绒螯蟹24 h全部死亡最低盐碱浓度和96 h全部存活最高盐碱浓度。盐、碱单一因素试验根据预试验结果采用等对数间距法均设置6个浓度梯度组及1个对照组，盐度梯度分别为20.00、22.97、26.38、30.32、34.81和40.00 g·L-1；碱度梯度分别为60、72、87、104、125和150 mmol·L-1，盐碱交互双因素试验浓度采用单独作用试验时前5个水平质量浓度50%，然后按照等水平均匀设计表要求设计5个质量浓度梯度。每个浓度梯度设3个平行组，每组10只中华绒螯蟹。试验期间水温保持（21.9±0.2）℃，持续充氧，每日换水1/3。试验开始后记录24、48、72和96 h蟹成活数和活动情况，试验过程中死蟹及时捞出。

1.4 数据处理与分析

试验数据通过SPSS 19.0作分析。盐、碱单独作用半致死浓度（LC50）及其95%置信区间采用寇氏法（Karber氏法）计算，计算公式如下：

式中，Xm为最高浓度对数；d为浓度对数差；Pi为死亡率；n为试验动物数；SD为标准差。

安全浓度SC参照陈小红等方法[12]计算：

盐碱交互双因素试验中将盐度和碱度浓度转换为水中所含溶质质量分数，试验结果运用SPSS 19.0作二项式回归分析[13]。

2 结果与分析

2.1 盐度对中华绒螯蟹的毒性作用

对照组中，中华绒螯蟹行为正常，但在盐度胁迫浓度组中，试验蟹反应较强烈，40 g·L-1处理组中毒反应强烈，短时间内出现躁动不安，游动速度加快等中毒现象。随胁迫时间增加，蟹游动迟缓，出现部分附肢脱落现象，个别蟹出现腹部上翻，身体僵直。26.38、30.32和34.81 g·L-1处理组蟹出现中毒反应时间稍晚，随胁迫时间增加，试验蟹也开始出现反应迟钝、抱团、少数附肢脱落、腹部上翻等中毒现象。20.00和22.97 g·L-1处理组蟹均未表现中毒反应。随盐度增加，不同处理时间中华绒螯蟹死亡率逐渐升高（见表1）。经计算，盐度对中华绒螯蟹在24、48、72和96 h时半致死浓度分别为35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全浓度为8.54 g·L-1。

表1 盐度对中华绒螯蟹毒性试验结果Table 1 Toxicity test results of salinity to Chinese mitten crab

2.2 碱度对中华绒螯蟹的毒性作用

在碱度胁迫条件下，蟹的行为反应与盐度胁迫一致，但整体出现中毒反应时间较晚。150 mmol·L-1处理组试验蟹在胁迫初期表现乱游现象，随胁迫时间增加，蟹体逐渐出现行动迟缓、抱团及附肢脱落现象。60和72 mmol·L-1处理组蟹在暴露初期均未出现异常，24 h后，个别个体开始逐渐出现游动变缓、反应迟钝、死亡等中毒症状。经计算，碱度对中华绒螯蟹在24、48、72和96 h时半致死浓度分别为110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全浓度为18.25 mmol·L-1（见表2）。

2.3 盐碱交互对中华绒螯蟹的毒性作用

在盐碱交互作用条件下，随盐碱浓度升高，蟹中毒现象明显，主要表现为短时间内急速游动，随盐碱暴露时间增加，行动逐渐迟缓，直至大部分蟹体静卧于试验缸底，部分蟹体出现附肢脱落。盐碱对中华绒螯蟹的交互作用结果见表3，中华绒螯蟹死亡率随溶液中盐度、碱度升高和暴露时间增加而升高。在碱度为62.5 mmol·L-1、盐度为17.41 g·L-1时96 h中华绒螯蟹死亡率达100%。根据武鹏飞等[13]试验方法分析数据获得胁迫24、48、72和96 h时中华绒螯蟹死亡率与盐碱关系拟合较好（R2＞0.95，P＜0.05）回归模型：

表3 盐碱联合对中华绒螯蟹的毒性试验结果Table 3 Toxicity test results of salt-alkali combination to Chinese mitten crab

式中，x1和x2分别代表盐度和碱度，y1、y2、y3、y4分别代表24、48、72和96 h死亡率，由回归模型分析得出：在所有回归模型中，盐度对死亡率表现为一元一次方程，而碱度对死亡率表现为一元二次方程。试验期间，盐度和碱度交互项系数均为正值，盐度和碱度对蟹死亡率表现为协同作用，表明盐碱交互条件下毒性作用强于单一盐度或碱度，在48～96 h协同系数逐渐增大，表明盐度和碱度协同作用在96 h表现最强，48 h表现最弱。

表2 碱度对中华绒螯蟹毒性试验结果Table 2 Toxicity test results of alkalinity to Chinese mitten crab

3 讨论

3.1 中华绒螯蟹对盐度的耐受性

水体盐度在一定程度上直接影响水生动物生长和发育[14]。一般情况下，水生动物主要通过渗透压调节适应环境水体盐度变化[15]。在盐度胁迫条件下，水生动物主要通过增加鳃中泌氯细胞数量和Na+-K+-ATP酶活性调节细胞内离子跨膜转运及物质能量代谢，从而调节体内外渗透压动态平衡[16]。不同水生动物在盐度胁迫下表现的渗透压调节能力不同，具体为其盐度半致死浓度和安全浓度存在差异。本研究中，通过对比分析半致死浓度和安全浓度表明，中华绒螯蟹对盐度耐受能力不仅高于鲤（Cyprinus carpio）[17]、彭泽鲫（Carassius auratusPengze）[18]等普通经济淡水鱼类，也高于凡纳滨对虾[6]、大鳞鲃[7]等耐盐碱水产动物，但其盐度耐受能力低于尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[19]。中华绒螯蟹作为广盐性高渗透调节物种在其繁殖期和幼体发育期需在淡、海水交界处完成[8]，此时中华绒螯蟹对盐度具有较强渗透压调节能力。随盐度进一步升高，水体环境中渗透压和离子浓度高于血浆时，中华绒螯蟹必须通过大量摄入高盐水维持自身血浆渗透压，当机体无法在短时间内完成“保水排盐”渗透调节时，机体内大量盐分无法及时排出[20]，此时蟹体渗透压平衡遭到破坏，机体代谢功能失调，当机体出现不可逆转的组织损伤时，机体开始死亡。

3.2 中华绒螯蟹对碱度的耐受性

碱度作为盐碱水域重要理化因子，对维持养殖水体pH及离子稳态具有重要意义[21-22]。研究表明，碱性环境造成水生动物鳃组织损伤，改变其能量代谢方式，并可能影响其正常脱壳和生长[23-25]。中华绒螯蟹在碱性胁迫时也呈现相似生理反应[26-28]。雷衍之等认为碳酸盐碱度对鱼体的影响是通过碱度与pH协同作用的结果[29]。在碳酸盐型盐碱水环境中，随碳酸盐碱度升高，水体中pH与HCO3-含量也随之升高，这些离子直接作用于水生动物鳃表面上皮细胞，导致其鳃上皮分离或破裂，氯细胞增生或肥大，从而影响细胞表面离子交换体系，同时，HCO3-也可通过影响血液中二氧化碳平衡系统，从而对水生动物产生危害[29]。鱼类由淡水进入碱性水体中，鱼体组织结构发生适应性改变，但这种改变无法超过鱼体耐受极限。雷衍之等在碳酸盐碱度对鱼类毒性作用的研究中提出，10 mmol·L-1碱度可作为常见淡水鱼养殖用水危险指标[29]。本试验结果表明，中华绒螯蟹碱度安全浓度为18.25 mmol·L-1，明显高于此数值。比对分析表明，中华绒螯蟹碱度半致死浓度高于澎泽鲫[18]、淡水白鲳（Colos soma brachypomum）[30]等高耐碱鱼类，且其安全浓度也明显高于凡纳滨对虾[6]、罗氏沼虾[5]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[31]等水产动物。以上结果表明，中华绒螯蟹对碳酸盐碱度具有较强耐受性。

3.3 中华绒螯蟹对盐碱联合的耐受性

本试验探究中华绒螯蟹对盐碱联合毒性耐受能力，结果表明，盐度和碱度对中华绒螯蟹联合毒性作用在96 h内全部表现为协同作用，62.5 mmol·L-1碳酸盐碱度和17.41 g·L-1盐度联合毒性作用使中华绒螯蟹在96 h内全部死亡。王桂春在盐度和碱度对中华绒螯蟹毒性作用的研究表明中华绒螯蟹在21.02 mmol·L-1碳酸盐碱度和8 g·L-1盐度联合胁迫96 h时全部死亡，其测定结果低于本试验，这可能与中华绒螯蟹品种、规格及试验环境条件不同有关[32]。另外，与其他水生动物相比，中华绒螯蟹在96 h内全部死亡的盐碱浓度高于罗氏沼虾[5]，略低于达里湖高原鳅[4]和克氏原鳌虾[33]。此外，盐碱联合作用于不同水生生物表现出不同联合效应。例如，盐碱联合对泥鳅[31]、克氏原螯虾[23]、达里湖鲫（Carassius auratus）[33]等毒性作用表现为拮抗作用，即盐碱联合作用毒性比盐度和碱度单独作用毒性总和弱；而对澎泽鲫[18]和淡水白鲳[30]表现为协同作用。

盐碱水对水生生物的影响是水体pH、盐度、碱度等多种因素综合作用结果，水体Cl-和HCO3-是其中最主要影响因素[2]。目前仅见盐碱联合毒性对鱼类影响的相关报道。赵丽慧等研究发现尼罗罗非鱼主要通过离子转运与渗透压调节过程响应盐碱胁迫，鳃组织中Na+-K+-ATP酶和碳酸酐酶则作为重要转运酶参与上述过程[34]；梁从飞等也探究盐碱交互作用对尼罗罗非鱼的影响，并认为盐碱混合条件下不同离子间存在协同作用[35]。参考上述鱼类相关研究结果，提出中华绒螯蟹被盐、碱胁迫激活的不同调节机制，并随时间增加机体耗能持续增加，最终导致能量不足，使盐碱胁迫对中华绒螯蟹的毒性作用加剧，这可能是盐碱联合毒性对中华绒螯蟹表现为协同作用的主要原因之一。目前，关于碱度及盐碱联合对中华绒螯蟹胁迫的研究较少，本文为后续中华绒螯蟹对盐度、碱度以及盐碱交互胁迫的响应机制等方面提供基础资料。

4 结论

本文开展中华绒螯蟹对盐度、碱度及盐碱交互耐受能力研究。结果表明，中华绒螯蟹在24、48、72和96 h时氯化钠（NaCl）盐度半致死浓度（LC50）分别为35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全浓度为8.54 g·L-1；在24、48、72和96 h的碳酸氢钠（NaHCO3）碱度半致死浓度（LC50）分别为110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全浓度为18.25 mmol·L-1。盐碱交互作用对中华绒螯蟹的毒性表现为协同作用。中华绒螯蟹对碳酸盐型盐碱水环境具有较强耐受性，适宜在盐度低于8.54 g·L-1或碳酸盐碱度低于18.25 mmol·L-1盐碱水域开展增养殖。