苯并芘胁迫对泥鳅外周血红细胞及抗氧化酶活性的影响

杨娜,潘鹏涛,董旭,范培月,吴航利,王佳,雷忻*

苯并芘胁迫对泥鳅外周血红细胞及抗氧化酶活性的影响

杨娜1,2,潘鹏涛1,2,董旭1,2,范培月1,2,吴航利1,2,王佳1,2,雷忻1,2*

1. 延安大学生命科学学院, 陕西 延安 716000 2. 延安市生态恢复重点实验室, 陕西 延安 716000

为研究苯并芘对鱼类外周血红细胞及抗氧化酶系的影响，本文以泥鳅作为研究对象，将其暴露于0、5、10、15 μg/LBaP溶液中20 d，分别在5、10、15、20 d时取样，采用血涂片微核测定法观察红细胞微核与核异常，采用邻苯三酚自氧化法和钼酸铵比色法分别检测肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性。结果表明，随着BaP浓度的升高和暴露时间的延长，泥鳅血红细胞微核率显著升高；随着BaP浓度的升高，泥鳅SOD、CAT活性在20 d的暴露期内呈现出先升高后下降的趋势。因此，BaP胁迫会对泥鳅产生一定的遗传毒性和氧化毒性效应，且毒性作用具有时间-剂量效应。

苯并芘; 泥鳅; 血红细胞; 抗氧化酶

苯并芘（Benzopyrene，BaP），作为一种典型的多环芳烃化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs），广泛分布于水生生态系统，以其强致癌、致畸、难降解的特性对水生生物产生毒害作用，造成环境污染、生物多样性下降[1,2]。近年来大量研究显示，淡水、海水水体及其沉积物中存在较高含量BaP，对生物体和周围环境造成极大影响[3,4]。例如，何跃华等研究发现，BaP浓度升高可对海洋生物贻贝造成组织器官氧化损伤，导致细胞转化和DNA链断裂，且存在一定的剂量-效应关系[5]；陈剑杰等通过检测BaP胁迫下鲤鱼肝、肾组织中抗氧化以及非特异性免疫能力发现，随着苯并芘暴露浓度的升高，鲤鱼肝脏、肾脏中SOD、CAT、GSH活性呈现出先上升后下降的趋势，对鲤鱼组织结构造成损伤[6]。随着陕北地区能源化工基地建设和社会经济发展，延河流域多环芳烃类化合物污染有加剧的趋势，其对水生生物的生理生态毒性研究更为迫切。

鱼类作为水体污染物通过食物链从自然环境向人体迁移的重要载体，是水生生态系统的重要组成部分，能直接或间接地反映水生生态系统的污染情况[7,8]。泥鳅（），隶属鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、泥鳅属()，是一类小型硬骨淡水鱼，在我国分布广泛，且其钻泥性强、易在实验室条件下驯养、对污染物较为敏感，故适宜作为实验材料[9,10]。本研究以泥鳅为实验动物，检测不同浓度梯度的BaP对泥鳅外周血红细胞微核诱导作用以及肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶活性（Catalase，CAT）的影响，为了解BaP对鱼类的遗传毒性和氧化毒性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用泥鳅平均体重在(10±2.3) g，平均体长在(10.5±2.1) cm。购自陕西省延安市水产动物养殖基地。在实验室条件下驯养14 d，使用自然晾晒96 h的脱氯自来水，期间喂食少量面包碎屑。挑取体格强健活跃的泥鳅进行实验，取样的前一天停止投食。

1.2 暴露实验

配制3组不同质量浓度苯并芘溶液：5（低浓度组）、10（中浓度组）、15（高浓度组）μg/L以及溶剂对照组。各浓度组设置3个生物学重复组，使用丙酮助溶，配制不同浓度梯度的BaP溶液，每只桶里放置12尾泥鳅。试验期间，每间隔24 h更换1次药物，以保证溶液吸收的氧气含量、酸碱度、温度和其它理化性质的稳定。换药后隔天喂食少量饲料或者面包屑，取样前一天不予喂食。实验期间每天对泥鳅进行观察，察看其体色和行为、能力变化，并及时将死亡个体捞出。

1.3 红细胞微核测定

分别在BaP溶液中5 d、10 d、15 d和20 d时取出泥鳅，进行断尾取血，制作血涂片，瑞氏-吉姆萨染液染色，用DM6B徕卡正置光学显微镜观察并拍照，每张片子统计3000个外周血细胞。采集核异常、微核图像并计算微核率。

1.4 肝脏抗氧化酶测定

分别取BaP溶液暴露5 d、10 d、15 d和20 d的泥鳅，快速处死，剖取肝脏，液氮研磨后按比例加入生理盐水、离心取上清液，保存在4 ℃冰箱。

采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性，用紫外分光光度计（UV-2600紫外分光光度计，日本津岛）在波长320 nm下读取OD值。钼酸铵比色法测定CAT活性，用紫外分光光度计在波长405 nm下读取OD值。

1.5 数据处理

实验数据用Excel处理以平均数（MEAN）±标准差（SD）表示，采用SPSS20.0进行方差分析（主要是LSD最小显著差数法和Duncun多重比较），根据分析结果用Origin绘图。

2 结果与分析

2.1 BaP对泥鳅红细胞微核与核异常的诱导

如图1中a箭头所示，正常红细胞呈椭圆形，形状规则，细胞核位于近中央位置。而在不同浓度BaP处理后，泥鳅血红细胞出现核异常情况，如核不规则现象，即图b箭头所指，可见泥鳅血红细胞核变形。图c箭头所指为核空泡现象，图d所示为微核现象，即细胞核周围细胞质会生出一个小小的椭圆形的核，一般为主核的1/5～1/20。图e中箭头分别指向染色质小颗粒现象。这些现象表明泥鳅在BaP胁迫下，血红细胞核受到一定的毒害作用。

图 1 BaP处理下泥鳅红细胞微核与核异常

a.正常红细胞（×100），b.核变形（×40），c.核空泡（×40），d.微核（×40），e.染色质小颗粒（×100）

a. Normal red blood cells（×100）, b. Nuclear deformation（×40）, c. Nuclear cavitation（×40）, d. Micronuclei（×40）, e. Chromatin granules（×100）

表 1 BaP对泥鳅外周血红细胞微核率的影响

注：*＜0.05，表示与对照组0 μg/L相较差异显著；**＜0.01，表示差异极显著。

Note: *P< 0.05, Compared with the control group (0 μg/L) , signifying significant difference; **< 0.01, signifying significant difference.

表1可见，BaP各处理组微核率显著高于对照组。在相同暴露时间，随着BaP浓度的升高，泥鳅红细胞微核率上升极其显著（＜0.01）；在相同浓度组，泥鳅红细胞微核率随暴露时间的延长而极显著上升（＜0.01），且在最高浓度15 μg/L暴露20 d时达到最大值。

2.2 BaP对泥鳅肝脏SOD活性的影响

图 2 BaP对泥鳅肝脏SOD活性的影响

注：*＜0.05，表示与对照组差异显著；**＜0.01，表示与对照组差异极显著；不同字母表示相同浓度组在不同时间差异显著。

Note: *<0.05, Compared with the Control Group, signifying significant difference; **<0.01, signifying significant difference, letters represent differences in time with the same concentration gradient.

如图2所示，与对照组相比较，暴露时间达到5 d时，3个BaP浓度处理组泥鳅肝脏SOD活性均呈极显著升高（＜0.01），同时，随着BaP浓度的升高，SOD活性值变化趋势表现出先升高后降低的特点，低浓度组（5 μg/L）BaP胁迫下，SOD活性值较其他2组（10 μg/L、15 μg/L）高。除高浓度组（15 μg/L）20 d时，各处理组泥鳅肝脏SOD活性与对照组相比均有极显著差异（＜0.01）。

3个浓度处理组（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）泥鳅在暴露时间达到10 d时SOD活性均显著下降（＜0.01），20 d时活性又显著上升（＜0.01），在中、高剂量组（10 μg/L、15 μg/L）下SOD活性值达到该组最低值。从暴露时间来看，3个浓度组SOD活性变化随暴露时间的延长呈先下降后上升的趋势，在胁迫中、中后期（10、15 d）时SOD活性达到最低值。

2.3 BaP对泥鳅肝脏CAT活性的影响

图 3 BaP对泥鳅肝脏CAT活性的影响

注：*＜0.05，表示与对照组差异显著；**＜0.01，表示与对照组差异极显著；不同字母表示相同浓度组在不同时间差异显著。

Note: *<0.05, Compared with the Control Group, signifying significant difference; **<0.01, signifying significant difference, letters represent differences in time with the same concentration gradient.

BaP胁迫下，泥鳅肝脏CAT活性变化如图3所示。与对照组相比，3个BaP浓度组（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）暴露5d泥鳅肝脏CAT活性均显著升高（＜0.01），同时，随着BaP浓度的升高，泥鳅肝脏CAT活性呈现出先升高后降低的趋势。3个BaP浓度组（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）中，随着胁迫时间的延长，泥鳅肝脏CAT活性呈现先降低后升高的趋势，在暴露中期（10 d）达到各浓度组最低值，分别为9.997、11.044、11.677 U/mL，在暴露后期（20 d）时达到最高值，分别为31.487、37.167、29.788 U/mL。且在相同浓度组不同暴露时间比较下，泥鳅肝脏CAT活性前、中期（5 d、10 d）并未有明显变化，中后、后期（15 d、20 d）呈显著升高。图中可见，随着BaP浓度的升高，CAT活性值会随之下降，呈现一定的剂量-效应关系。这也说明，BaP胁迫浓度的升高，导致泥鳅肝脏CAT活性恢复缓慢。

3 讨论

3.1 BaP对泥鳅遗传毒性效应

鱼类外周血红细胞微核率的变化，反映其染色体是否出现损伤和损伤程度，进一步指示环境污染情况[11]。蒋玫等[12]通过彗星实验研究BaP对缢蛏红细胞DNA损伤发现，随着BaP浓度的增大和暴露时间的延长，红细胞DNA链断裂损伤程度以及带尾彗核DNA百分比增加。姜姗等[13]在研究重金属对泥鳅细胞DNA损伤及金属硫蛋白表达影响中发现，暴露在不同浓度硫酸铜和氯化锌溶液中，泥鳅鳍细胞拖尾率、彗尾DNA比例以及彗尾尾长均显著高于对照组，表现出一定的遗传毒性。

本研究通过20 d的静水实验法发现，BaP胁迫下泥鳅外周血红细胞出现微核、胞质突起、核固缩等核异常现象，血红细胞微核率与BaP暴露浓度以及暴露时间呈正相关，说明一定浓度BaP暴露会诱导泥鳅血红细胞微核以及核异常现象，这种损伤会随着BaP胁迫浓度的升高和胁迫时间的延长而加剧，可能是由于BaP胁迫使得泥鳅红细胞染色体发生断裂和损伤，形成微核，导致微核率升高。该实验结果证明了泥鳅血红细胞对环境污染物BaP响应较为敏感，进一步应用于污染物胁迫下鱼类遗传毒性效应的环境评价。

3.2 BaP对泥鳅氧化毒理效应

已有研究表明，当生物体在受到污染物诱导产生较多的自由基时，体内酶促抗氧化保护机制会被激活，超氧歧化酶、过氧化氢酶活性可以被诱导或抑制[14-16]。戚珍珠等[17]通过研究幼龄泥鳅对壬基酚（Nonylphenol，NP）胁迫的抗氧化酶系响应发现，在15 d的暴露周期内泥鳅肝脏SOD以及CAT活性随NP质量浓度增大而升高。Strobel Anneli等[18]探究BaP胁迫下南极鱼超氧化物歧化酶的变化中发现，暴露在10和100 mg/kgBaP下其肝脏SOD水平一直保持在较高水平。

本研究结果显示，随着BaP胁迫浓度的升高，泥鳅肝脏SOD活性呈现出先诱导后抑制的特点。在各个BaP暴露浓度组，泥鳅肝脏SOD活性在暴露早期（5～10 d）表现出抑制作用，这说明BaP对泥鳅肝脏造成了氧化损伤，随着时间的延长SOD活性升高说明泥鳅在适应环境的过程中，体内抗氧化保护机制被激活，抵御自身受到的氧化损伤。尚泰宇[19]在氰氟草酯胁迫对泥鳅抗氧化酶活性影响研究中发现，氰氟草酯胁迫对泥鳅体内SOD活性影响随着暴露浓度的升高表现为先抑制后诱导的趋势，这与我们的实验结果一致。此外，本实验还发现在高浓度BaP暴露下，泥鳅肝脏SOD活性虽也表现出先抑制后诱导，但其诱导作用并没有低浓度的显著，我们判断可能是因为苯并芘对泥鳅肝脏造成了不可逆损伤，导致泥鳅SOD活性恢复缓慢。

过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，避免生成非常有害的-OH[20,21]。研究表明，随着污染物浓度的升高，生物体内CAT活性会随着SOD活性上升同时被激活，抵御减少氧化应激损伤，但随着污染物浓度的持续升高、不断对生物体造成破坏导致CAT活性被抑制。蒋润兰等[22,23]通过对菲胁迫下中华绒螯蟹急性毒性效应的研究表明，各浓度梯度菲暴露下肝胰腺和鳃组织中的CAT活性被诱导呈现显著的剂量-效应关系。再者，关晓燕等[24]通过研究虾夷扇贝暴露在BaP下血清SOD、CAT活性发现，SOD活性与CAT活性变化在前期呈显著负相关、后期显著负相关，且具有显著的剂量-效应关系和时效关系。

在本研究中，随着BaP浓度的升高，泥鳅肝脏中CAT活性呈现出先诱导后抑制的特点。暴露前期（5～10 d），泥鳅肝脏CAT活性表现出抑制作用，随着暴露时间的延长（15～20 d）CAT活性升高，表明泥鳅对所处环境已经有了一定的适应。比较可见，随着BaP浓度的升高，泥鳅肝脏SOD和CAT活性都呈现先上升后下降的趋势。出现这种情况的原因可能是低浓度BaP暴露下，泥鳅体内染毒、内稳态遭到破坏，体内SOD和CAT活性被诱导；但随着BaP暴露浓度的升高，生物的自我调节能力有限、机体损伤严重，故SOD和CAT活性被抑制。同时，在各浓度梯度组中，随着暴露时间的延长，泥鳅肝脏SOD和CAT活性都呈现先下降后上升的趋势。这可能是由于在暴露早期泥鳅急性染毒各项生理指标下降，导致暴露早、中期（5 d、10 d）泥鳅肝脏SOD、CAT活性下降，随后各项生理指标逐渐恢复，机体抵御减少氧化应激损伤，导致SOD、CAT活性被诱导。

此外，我们还发现苯并芘胁迫下对泥鳅肝脏CAT活性与SOD活性诱导存在一定的差异，这主要体现在暴露早期对SOD抑制作用较CAT强；随着BaP暴露时间延长，BaP对CAT活性的诱导作用较SOD显著，这也说明CAT活性对BaP胁迫更为敏感。Liang J等[25]在十溴联苯醚和铁对蚯蚓抗氧化酶系影响研究中，也得到了CAT活性诱导作用更为敏感的结果。

因此，我们在应用抗氧化酶系对水体内苯并芘监测时，生物体血红细胞微核率、SOD活性、CAT活性这几个指标可用于监测环境，且从SOD活性与CAT活性两项指标的变化进行分析，依据二者作用的不一致性综合分析，能够更准确的分析苯并芘的环境毒理学效应。

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Effects of Benzo(a)pyrene Stress on Erythrocyte and Antioxidant Enzyme Activities in the Peripheral Blood of

YANG Na1,2, PAN Peng-tao1,2, DONG Xu1,2, FAN Pei-yue1,2, WU Hang-li1,2, WANG Jia1,2, LEI Xin1,2*

1.716000,2.716000,

To study the effect of Benzo(a)pyrene on erythrocyte and antioxidant enzyme activities in fish, loach was exposed to 0,5,10 and 15 μg/L BaP solution for 20 days. During the BaP treatment, the blood and liver were collected on 5,10,15 and 20 days. The erythrocyte micronucleus and nuclear abnormality were detected by blood smear, the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in liver were measured by pyrogallol autoxidation and ammonium molybdate colorimetry. The results showed that: (1) With the increase of BaP concentration and exposure time, the micronucleus rate of erythrocytes ofincreased significantly. (2) With the increase of BaP concentration, the activities of SOD and CAT ofincreased at first and then decreased during 20 days of exposure. Therfore, BaP stress could induce certain genotoxicity and oxidative toxicity to, and the toxicity had time-dose effect.

Benzo(a)pyrene;; blood erythrocyte; antioxidant enzymes

S917

A

1000-2324(2021)06-0936-06

2021-04-27

2021-05-15

陕西省自然科学基础研究计划面上项目(2021JM-417);延安市科技惠民计划项目(2017HM-05);陕西省大学生创新创业训练计划项目(S201910719037)

杨娜(1997-),女,在读研究生,主要从事水生态毒理学研究. E-mail:yangna970618@126.com

通讯作者:Author for correspondence. E-mail:leizz66@126.com