纳米碳对百合试管苗生长代谢及生理特性的影响

张芳,任建宏,王育选,赵娟*

纳米碳对百合试管苗生长代谢及生理特性的影响

张芳1,任建宏2,王育选2,赵娟2*

1. 山西农业大学 信息学院, 山西 太谷 030801 2. 山西农业大学农学院, 山西 太谷 030801

为研究纳米碳对百合试管苗生长代谢及生理特性的影响，在优化百合试管苗培养基的同时，探讨纳米碳在离体培养中的作用，为其应用于植物组织培养提供理论参考。本文以平陆百合脱毒试管苗为外植体，接种于附加不同浓度纳米碳的培养基中，了解纳米碳对百合鳞茎膨大、生根、增殖等生长情况的影响，并测定其干重、叶绿素含量、根系活力、全氮含量等生理指标，分析纳米碳对百合试管苗生理代谢的影响。结果表明：纳米碳对百合试管苗鳞茎膨大、增殖、生根、物质积累、根系活力、抗氧化性等均表现不同程度的促进作用。百合试管苗膨大、增殖倍率、生根数、地上部和地下部干重、全氮、还原糖、Vc含量、根系活力、叶绿素含量、SOD、POD、CAT活性基本随纳米碳浓度提高先升高后降低，MDA含量则先降低后升高，这些指标达到峰值时所需的纳米碳浓度不同。综合分析，纳米碳适宜的附加浓度为400～600 mg·L-1，可调节百合试管苗生理生化过程，明显促进其生长。

纳米碳; 百合; 试管苗; 生长代谢; 生理特性

纳米技术是在纳米（10-9m～10-7m）范围内认识和改造物质，是21世纪三大新兴技术之一。纳米碳是一种低燃点、非导性的改性碳，作为纳米材料具有低毒等其它材料所不具备的优良特性，在环境、能源、医药等领域得到广泛应用[1-3]。在农业方面，其研究主要集中于纳米碳促进大田植物生长发育和提高肥效[4-6]，应用于植物组织培养方面的相关报道很少，烟草细胞培养发现，纳米碳可以促进烟草细胞的生长[7]；冯璐等研究表明适宜浓度的纳米碳对红掌、大花蕙兰、金昌枣等试管苗生长有促进作用[8]；我们前期试验结果表明纳米碳能够促进百合鳞片分化[9]。尚未见到关于纳米碳对组培试管苗生长代谢及生理特性影响的相关报道。

平陆百合(var)是山西省平陆县特有的食用百合品种，属百合科百合属，多年生草本球根植物，其鳞茎营养丰富，被誉为“中条参”，具较高营养价值和经济价值[10-13]。百合常规繁殖以鳞茎分株为主，易受病毒感染，导致种球品质退化、产量下降，茎尖脱毒培养获得脱毒苗是解决这一问题的主要途径，快繁可提供大量脱毒种球。但长期快繁过程中反复继代培养会导致百合脱毒试管苗出现鳞茎退化、繁殖系数低、叶片徒长等问题[14,15]。通过调整激素种类和配比，低温处理及附加其它调节生长的物质，可改善试管苗生长受抑制的现象。纳米碳对百合试管苗生长及代谢是否有促进作用尚不明确。

本试验以百合脱毒试管苗为材料，在培养基中附加不同浓度纳米碳，研究其对百合试管苗生长发育和生理代谢特性的影响，明确纳米碳能否对百合试管苗生长起促进作用，并筛选出纳米碳的适宜添加浓度，优化百合脱毒试管苗继代和生根培养基，提高试管苗质量，为植物组织培养过程中使用纳米碳促生长提供新的思路和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

平陆百合（var.）脱毒试管苗由山西农业大学农学院植物组织培养实验室前期试验获得。纳米碳（C>90%，粒径40 nm～80 nm）由山西华农纳米科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 平陆百合脱毒试管苗的培养平陆百合脱毒试管苗继代培养基1为MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，继代培养基2为MS+ZT 2.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，生根培养基为1/2 MS+ NAA 0.8 mg·L-1。琼脂6g·L-1，PH为5.6～5.8，培养温度25±2 ℃，光照14 h·d-1，光照强度2000～3000 lx。

1.2.2 纳米碳处理选取继代培养获得的均一健壮试管苗，接种到附加不同浓度纳米碳（200、400、600、800、1000 mg·L-1）的上述3种培养基中，以不添加纳米碳的处理为对照，培养条件同上，每处理重复3次，接种40 d后，观察统计百合鳞茎膨大、增殖和生根情况。

1.2.3 生理指标的测定在生根培养基中附加不同浓度纳米碳（200、400、600、800、1000 mg·L-1），接种百合脱毒试管苗60 d后进行下列指标的测定。从鳞茎基部将百合试管苗地上部和地下部切分，分别在105 ℃下杀青30 min，80 ℃下烘干，测定其干重[16]；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定根活力[17]；采用丙酮法测定叶片叶绿素含量[17]；采用半微量凯氏定氮法测定全氮含量[18]；采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[17]；采用分光光度计法测定Vc含量[19]；采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定SOD活性[17]；采用愈创木酚法测定POD活性[17]；采用紫外吸收法测定CAT活性[17]；采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量[17]。

1.3 数据分析

采用Excel 2013软件对数据进行统计并制图，使用DPS7.05对数据进行多重比较和方差分析。

2 结果与分析

2.1 纳米碳对百合试管苗生长及干重的影响

不同小写字母表示同一品种同一组织不同干旱胁迫程度下的差异显著（＜0.05），下同。

Different lowercase alphabets indicate significant differences of the same variety and tissue under different drought stress levels at 0.05 level. The same as below.

2.1.1 对百合鳞茎膨大的影响由图1-A可见，在继代培养基1中附加不同浓度的纳米碳均可促进百合鳞茎膨大，且在200 mg·L-1～1000 mg·L-1范围内，鳞茎膨大倍数呈先升高后降低的趋势。附加浓度为600 mg·L-1时，鳞茎膨大较对照增加了3.04倍，且生长健壮（图2-A）。

2.1.2 对百合鳞茎增殖的影响相较于对照，在继代培养基2中添加不同浓度的纳米碳均可促进百合鳞茎增殖，且在所设范围内，鳞茎增殖倍率呈先升高后降低的趋势（图1-B）。各处理间差异明显，以附加600 mg·L-1纳米碳时，百合鳞茎增殖效果最好，增殖倍率达9.8倍（图2-B）。

2.1.3 对百合试管苗生根的影响将不同浓度纳米碳附加于生根培养基中，培养过程中发现，纳米碳对试管苗生根率和根长没有明显促进作用，但可显著促进试管苗生根数增加（图1-C，图2-D）。以附加400 mg·L-1纳米碳时，百合试管苗生根数达12.73条，且根健壮，适于移栽（图2-C）。

2.1.4 对百合试管苗各部分干重的影响由图1-D可见，在培养基中附加不同浓度纳米碳均可促进百合脱毒试管苗生长，其地上部和地下部干重积累增加。提高纳米碳浓度，百合试管苗地上部和地下部干重积累先增加后减少，尤其在附加浓度为600 mg·L-1时，二者达到最大值，明显高于对照，说明纳米碳促进百合生长作用明显。

图 2 纳米碳对百合试管苗生长的影响

A: 鳞茎的膨大Enlargement of bulbs; B鳞茎的增殖Multiplication of bulbs; C-D:试管苗生根Rooting of test-tube plantlets

2.2 纳米碳对百合试管苗几种代谢物含量的影响

2.2.1 对百合各器官全氮含量的影响由图3-A可知，培养基中添加不同浓度纳米碳后，其叶片、鳞茎和根的氮含量均较对照有不同程度的提高，但不同器官所需的纳米碳适宜浓度不同。叶片和鳞茎全氮含量达到最大值时所需纳米碳浓度为600 mg·L-1，在此浓度下其含量别比照增加了202.95 mg·g-1和79.73 mg·g-1。根系全氮含量则在纳米碳浓度为200 mg·L-1是达到最大，为133.39 mg·g-1，比对照增加了21.86 mg·g-1。说明纳米碳对百合各器官中氮素积累有一定促进作用，尤其是对叶片中氮素的积累作用更为显著。

2.2.2 对百合鳞茎还原糖含量的影响与对照相比，培养基中附加低浓度纳米碳对百合试管苗鳞茎中还原糖合成没有明显促进作用，提高纳米碳浓度至600 mg·L-1以上可明显促进还原糖含量增加。以添加800 mg·L-1纳米碳时，还原糖含量最大，达31.78 mg·g-1，比照提增加了7.01 mg·g-1（图3-B）。

2.2.3 对百合鳞茎Vc含量的影响百合试管苗鳞茎中Vc含量随培养基中附加纳米碳浓度升高出现上下波动变化，但与对照相比均有增加（图3-C）。附加浓度为600 mg·L-1时，鳞茎中Vc含量达到最大，为22.91 mg·g-1，比对照增加了5.54 mg·g-1。

图 3 不同浓度纳米碳对百合试管苗代谢物含量的影响

2.3 纳米碳对百合脱毒试管苗生理特性的影响

2.3.1 对百合试管苗根系活力的影响在培养基中添加不同浓度纳米碳后，百合试管苗根系活力呈现先升高后降低的趋势（图4）。纳米碳浓度在200 mg·L-1～800 mg·L-1范围内均可促进根系活力提高，以添加400 mg·L-1纳米碳时，根系活力达到最大，为936.31 µg·g-1·h-1，比对照上升29.5%，显著高于对照和其它处理浓度。纳米碳浓度提高至1000 mg·L-1时，根系活力下降，低于对照。

2.3.2 对百合试管苗叶片叶绿素含量的影响与对照相比，在培养基中附加纳米碳可提高叶绿素含量，且浓度范围内不同浓度作用下，叶绿素a和叶绿素b含量均高于对照，但达到最大值时所需纳米碳浓度略有差异（图5）。叶绿素a含量在附加纳米碳浓度为400 mg·L-1时达到最大值，比对照增加了0.205 mg·g-1；叶绿素b含量则在纳米碳浓度为600 mg·L-1时达到最大值，比对照增加了0.115 mg·g-1。

图 4 不同浓度纳米碳对百合试管苗根系活力的影响

图 5 不同浓度纳米碳对百合试管苗叶片叶绿素含量的影响

2.3.4 对百合试管苗抗氧化性的影响由图6可见，随着附加纳米碳浓度的升高，百合试管苗叶片和鳞茎中的抗氧化酶系SOD、POD、CAT活性均先升高后降低，出现峰值时所对应的纳米碳浓度不同，以附加纳米碳浓度为400 mg·L-1～600 mg·L-1时显著高于对照。这与细胞中MDA含量先降低后升高相对应，说明纳米碳增强了细胞的抗氧化性，减少MDA积累。

图6 不同浓度纳米碳对百合试管苗抗氧化性的影响

3 讨论

纳米碳颗粒微小，可完全溶于水而成为超导体，促进根系吸水，进而促进植物对矿质元素的吸收，在植物物质代谢和生长发育方面表现出良好的促进作用[2]。本试验结果表明，在培养基中附加不同浓度纳米碳可不同程度地促进百合试管苗鳞茎膨大、增殖，并促进试管苗生根量增加，促进百合试管苗各部分干物质积累。这与王佳琦等[20]、杨健等[21]、梁太波等[22]在大田植物玉米、烤烟上得到的研究结果相似。离体培养物在生根培养之前多数为无根材料，直接吸收培养基成分，纳米碳可促进没有生根的鳞茎膨大和增殖与其强吸附性有关，可以有效地促进培养物对培养基中水分、矿质元素及有机物的吸收，这是促进鳞茎膨大和增殖的重要原因。

在生根培养基中添加纳米碳可明显增加百合试管苗生根量、提高根系活力，能够进一步促进百合试管苗对养分的吸收。本研究发现，使用纳米碳后，百合试管苗叶片、鳞茎、根系中氮含量均明显高于对照，说明纳米碳促进了氮素的吸收和在百合试管苗各部分的积累。同时试管苗鳞茎的还原糖和Vc含量，试管苗叶片叶绿素含量也明显高于对照，这与马兴立等[23]研究结果相似。说明纳米碳对百合试管苗物质代谢合成也表现明显的促进作用。这与大田植物上得到的纳米碳促进对氮素的吸收，提高其叶绿素含量，促进植物生长的结论一致[24-26]。

研究表明，将纳米碳加入基肥或追肥中均可降低氮素土壤残留，显著提高大田作物氮肥利用率。纳米碳颗粒尺度小、表面能活性高，能以聚合物的形式与土壤中的营养离子结合，促进植物吸收和利用养分。但本文将纳米碳添加入培养基中，促进离体培养材料的生长代谢，其作用机理可能又有所不同，单从纳米碳的高吸附性上已不能完全解释其促生长和吸收的机制。本试验中也从提高植物抗氧化性上做了初步研究，结果表明，纳米碳可以提高抗氧化酶SOD、POD、CAT活性，降低细胞MDA含量，减小细胞受损程度，这可能也是纳米碳促生长的原因之一；赵振杰等[27]的研究认为纳米碳能显著提高离体培养的烟草细胞水通道蛋白基因和细胞周期蛋白基因的表达量，这是促进愈伤组织生长的基础，但要全面了解纳米碳促进离体培养物生长和分化的机理还需要进一步深入研究。

4 结论

从百合试管苗外部形态看，培养基中添加适宜浓度的纳米碳可以促进百合试管苗鳞茎膨大和增殖，促进试管苗生根数增加。从内部代谢看，纳米碳提高根系活力，促进营养吸收和积累，氮素、还原糖和Vc含量增加，促进叶绿素合成，提高抗氧化酶活性，减少细胞损伤，促进试管苗生长。

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Effect of Nano-carbon on the Growth Metabolism and Physiological Characteristics of Lily Test-tube Plantlet

ZHANG Fang1, REN Jian-hong2, WANG Yu-xuan2, ZHAO Juan2*

1./030801,2./,030801,

In order to study the effect of nano-carbon on the growth and metabolism and physiological characteristics of lily tube seedling, the role of nano-carbon in vitro culture was studied while optimizing the culture medium of lily tube seedling so as to provide theoretical reference for its application in plant tissue culture. In this paper, the virus-free plantlets of Lilium pinglu were used as explants and inoculated in the medium supplemented with different concentrations of nano carbon. Thus the effects of nano carbon on lily bulb expansion, rooting and proliferation were investigated as well as the physiological indexes such as dry weight, Chlorophyll content, root activity and total nitrogen content were measured to analyze the influence of nano carbon on the physiological metabolism of Lily tube seedlings. The results showed that the nano-carbon had different degree of promoting effect on the bulbous expansion, its proliferation, root activity, rooting matter accumulation, antioxidant activity of Lily test-tube plantlet. Lily tube seedlings inflated, proliferation rate, rooting number, above-ground dry weight as well as underground dry weight, total nitrogen, reducing sugar, Vc content, root activity, Chlorophyll content, SOD, POD, CAT activity basically increased first and then decreased with the increase of nano carbon concentration while MDA content decreased first and then increased instead. And the concentration of nanocarbon required would be different when these indexes reach to peak. According to the comprehensive analysis, the appropriate additional concentration of carbon nanoparticles was 400～600 mg·L-1, which could regulate the physiological and biochemical process of lilium tube-seedling and significantly promote its growth.

Nano-carbon; Lily; test-tube plantlet; growth metabolism; physiological characteristics

S644.1

A

1000-2324(2021)06-0911-05

2020-02-12

2020-04-13

山西省面上青年基金项目(201601D202054);山西省科技攻关项目(20130311014-1);山西农业大学博士科研启动项目(2012YJ13)

张芳(1982-),女,硕士研究生,研究方向:植物组织培养. E-mail:910380646@qq.com

通讯作者:Author for correspondence. E-mail:sxndzhaojuan@163.com