茉莉酸对马铃薯苗期低温胁迫耐性的影响

刘计涛，王梦诗，索海翠，罗焕明，王 丽，李成晨，单建伟，廖永珊，李小波

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】马铃薯（Solanum tuberosum）是我国重要的粮菜兼用作物，总产量和种植面积均居世界首位，在保证国家粮食安全和蔬菜周年供应中发挥重要作用，是高效农业的重要组成部分。马铃薯为喜冷凉不耐低温作物，容易遭受冬春季自然寒害，严重影响产量。茉莉酸是重要的植物激素之一，在调节非生物胁迫和生物胁迫中发挥了重要的功能，但关于茉莉酸影响马铃薯抗寒性的研究还较少，因此，探索茉莉酸对马铃薯低温胁迫耐性的影响，有助于解析马铃薯抗寒生理机制，并为其在生产中推广应用提供参考。【前人研究进展】低温胁迫是威胁温带和热带植物的主要环境因素之一［1］，会导致植物中活性氧（ROS）过度积累造成核酸、蛋白质和脂质等大分子物质的氧化损伤，最终破坏细胞功能，造成植物死亡［2］［3］。茉莉酸（JA）是一种重要的植物激素，其参与调节许多生理进程，如根抑制［4］、花青素积累［5］、毛状体形成［6］、雄性发育［7-8］、叶片衰老［9-11］、生物和非生物胁迫响应等［12-16］。前人的研究表明，外源处理MeJA 能够显著提升模式植物拟南芥在非冷驯化条件下的抗寒性［17］，以及冷胁迫下水稻幼苗的存活率［18］，在番茄中JA 能够促进腐胺的合成降低氧化胁迫提高低温胁迫耐性［19］。外源JA 处理能够通过缓解氧化胁迫，维持细胞稳态和提高抗氧化能力增强紫苏、颠茄、小麦的抗寒性［20-22］。ICE（Inducer of CBF expression）—CBF 转录调节模块在植物低温胁迫响应中起着重要的作用［23］，在拟南芥中低温胁迫能够激活ICE-CBF 蛋白诱导大量的COR（Coldregulated）基因的表达，最终提升拟南芥的低温胁迫耐性［24］。有研究报道，JA 能够正调节ICE-CBF 通路，增强拟南芥的低温胁迫耐性［17］。这些研究表明，JA 在调节植物低温胁迫耐性中发挥重要的功能。在马铃薯中，前人的研究发现JA能够提升马铃薯对晚疫病的抗性［25］，影响块茎发育等［26］，而关于JA 调节马铃薯抗寒性的研究还较少。因此，探索JA 调节马铃薯抗寒的机制对于马铃薯抗寒育种和栽培具有重要意义。【本研究切入点】以马铃薯冬作区主栽品种费乌瑞它为研究对象，针对冬作区寒害频发严重影响产量这一现状，以及农民对马铃薯抗寒栽培技术和品种的需求，利用外源JA 处理并通过酶活性分析和抗寒相关基因CBF的表达模式确定马铃薯最适JA 使用浓度。【拟解决的关键问题】探讨JA 调节马铃薯低温胁迫耐性的最适浓度，以及其对马铃薯活性氧及其清除酶的影响，揭示JA 影响马铃薯抗寒性的生理特性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试马铃薯品种为费乌瑞它，种薯购自天津市天兴佳业科技有限公司，保存于冷库中，试验前放置于室内待种薯发芽后切块，在实验室光照培养室进行盆栽；供试盆规格为盆底直径22 cm，高25 cm，盆口直径30 cm；基质为草炭土混合珍珠岩比例为2∶1。

茉莉酸购自上海麦克林生化科技有限公司，用适量无水乙醇彻底溶解后，再缓慢加入水定容至0.1 mol/L作为母液，然后根据试验所需浓度（50、100、200、400 μmol/L）进行稀释定容，以去离子水作对照。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理与采集 试验于2021 年9 月11日在广东省农作物遗传改良重点实验室进行，马铃薯出苗2 周的盆栽苗，每盆保留1～2 棵长势一致的幼苗，继续在长日照（光照16 h）条件下培养2 周后备用。选取25 盆长势一致的马铃薯盆栽苗平均分为5 组，每组5 个生物学重复，分别用50、100、200、400 μmol/L 茉莉酸和去离子水喷施叶片，24 h 后放入低温光照培养箱（达斯卡特DGZC-P1000B），以-2 ℃低温胁迫处理5 h，分别选取处理0、5 h 顶部生长第3～4 片功能叶置于液氮中，用于下一步分析。

1.2.2 测定项目及方法 过氧化氢含量：采用过氧化氢含量检测试剂盒（BC3590，北京索宝莱科技有限公司），将马铃薯叶片于液氮中研磨成粉末，称取0.1 g 加入1 mL 丙酮提取液并迅速涡旋震荡混匀，并置于冰上10 min 充分反应，4 ℃、8 000 g 离心10 min，取全部上清液，置冰上待测，然后参照试剂盒测定方法，用分光光度计进行测定，调整波长至415 nm，记录吸光值，蒸馏水调零。计算公式为：

H2O2（μmol/g ）=ΔA测定÷ΔA标准÷W

式中，ΔA测定=A测定管-A空白管，ΔA标准=A标准管-A空白管，A 为波长415 nm 处吸光度OD415，W 为样品质量（g）。

马铃薯过氧化氢酶（CAT）活性：采用过氧化氢酶活性检测试剂盒（BC0200，北京索宝莱科技有限公司），将马铃薯叶片于液氮中研磨成粉末，称取0.1 g 样本加入1 mL 提取液并迅速涡旋震荡混匀，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g 离心10 min，取全部上清液，置冰上待测，然后参照试剂盒测定方法，用分光光度计进行测定，调整波长至240 nm，记录吸光值，蒸馏水调零。取1 mL CAT 检测工作液于1 mL 石英比色皿中，再加入35 μL 酶提取液，混匀5 s，室温下立即测定240 nm 下的初始吸光值A1 和1 min 后的吸光值A2。

CAT 活性（U/g ）=678×ΔA÷W

式中，ΔA=A1-A2，A 为波长240 nm 处吸光度OD240，W 为样品质量（g）。

马铃薯过氧化物酶（POD）活性：采用过氧化物酶活性检测试剂盒（BC0090，北京索宝莱科技有限公司），将马铃薯叶片于液氮中研磨成粉末，称取0.1 g 样本加入1 mL 提取液并迅速涡旋震荡混匀，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g 离心10 min，取全部上清液，置冰上待测，然后参照试剂盒测定方法，用分光光度计进行测定，调整波长至470 nm，记录吸光值，蒸馏水调零。在1 mL 玻璃比色皿中按顺序加入试剂盒试剂，立即混匀并计时，记录470 nm 下30 s 的吸光值A1 和90 s 后的吸光值A2。

POD 活性（U/g ）=7133×ΔA÷W，ΔA=A2-A1

超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用超氧化物歧化酶活性检测试剂盒（BC0170，北京索宝莱科技有限公司），将马铃薯叶片于液氮中研磨成粉末，称取0.1 g 样本加入1 mL 提取液并迅速涡旋震荡混匀，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g离心10 min，取全部上清液，置冰上待测，然后参照试剂盒测定方法，加入测定试剂后充分混匀，37 ℃水浴30 min 后，置于1 mL 玻璃比色皿测定560 nm 下的吸光度，蒸馏水调零。

式中，ΔA测定=A测定-A对照，ΔA空白=A1空白-A2空白，A 为波长560 nm 处吸光度OD560，W 为样品质量（g）。

1.2.3 基因表达分析 分别在Solanaceae Genomics Resource网站（www.spuddb.uga.edu/index.shtml）数据库获得MYC2和CBF1-3的序列，利用NCBI Primer Blast进行引物设计（表1）和特异性比对分析。以JA处理马铃薯叶片提取的RNA，利用反转录试剂盒（擎科，Code No.TSK302M）得到cDNA模板，采用2×TSINGKE®Master qPCR Mix（SYBR Green I with UDG）（擎科，Code No.TSE203）进行实时荧光定量（QRT-PCR）分析，ef1a作为内参基因，获得不同基因的相对表达量，数据分析采用2-ΔΔCt法。每个样品3次生物学重复，3次技术重复。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

2 结果与分析

2.1 JA 对马铃薯活性氧含量的影响

由图1 可知，JA 处理24 h 后马铃薯叶片过氧化氢的含量随着JA 浓度的增加显著降低，对照过氧化氢含量最高为0.856 μmol/g，其中50 μmol/L JA 处理过氧化氢含量略有降低但不显著，100 μmol/L JA 处理后开始显著降低，以200 μmol/L JA处理后达到最低点0.275 μmol/g，400 μmol/L JA处理比200 μmol/L JA 处理略有升高但均比对照显著降低；经低温胁迫4 h 后，与低温胁迫前相比过氧化氢含量均显著升高，且趋势与低温胁迫前一致，其中对照的过氧化氢含量仍是最高、为2.176 μmol/g，200 μmol/L JA 处理最低、为1.139μmol/g。这表明JA 浓度为200 μmol/L 的处理效果最好，其次为400 μmol/L。

图1 不同JA 浓度处理对低温胁迫条件下过氧化氢含量的影响Fig.1 Effects of different JA concentrations on hydrogen peroxide content under cold stress

2.2 JA 对活性氧清除酶活性的影响

2.2.1 过氧化氢酶（CAT）活性 由图2 可知，JA 处理24 h 后，马铃薯叶片CAT 活性总体随着JA 浓度增加而增强，与蒸馏水对照相比，50 μmol/L JA 处理4 h 后CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至325.07 μmol/g，显著增强1.99 倍，100、200、400 μmol/L JA 处理的CAT 活性比50 μmol/L JA 处理略有升高但不显著，分别为对照的2.16、2.31、2.33 倍；低温胁迫4 h 后，与胁迫前（0h）相比，蒸馏水对照的CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至328.13 μmol/g，显著增强2.01 倍，而50 μmol/L JA 处理的CAT 活性变化不明显，但100、200、400 μmol/L JA 处理的CAT 活性显著增强，分别为367.83、426.56、455.76 μmol/g，为对照的1.12、1.30、1.39 倍。表明200 μmol/L JA 处理效果最好，其次为100、400 μmol/L JA 处理。

图2 不同JA 浓度处理对低温胁迫条件下CAT 活性的影响Fig.2 Effects of different JA concentrations on CAT activity under cold stress

2.2.2 过氧化物酶（POD）活性 如图3 所示，与蒸馏水对照相比，50 μmol/L JA 处理24 h 后，马铃薯叶片POD 活性变化不显著；当JA 浓度增加至100 μmol/L 时，POD 活性由89.59 U/g 显著增加至171.73 U/g，为对照的1.3 倍；JA 浓度继续增加至200、400 μmol/L 时，POD 活性分别为对照的2 倍（181.24 U/g）和2.1 倍（195.05 U/g）。低温胁迫4 h 后POD 活性比0 h 显著增强，与蒸馏水对照相比，50 μmol/L JA 处理的POD 活性略有增强但不显著；JA 浓度增加至100 μmol/L 时，POD 活性比对照增强1.81 倍；200 μmol/L JA 处理的POD 活性显著提升，为对照的2.53 倍；400 μmol/L JA 处理与200 μmol/L JA 处理效果相似，为对照的2.63 倍。表明低温胁迫400 μmol/L JA处理的POD 活性最强，其次为200、100 μmol/L JA 处理。

图3 不同JA 浓度处理对低温胁迫条件下POD 活性的影响Fig.3 Effects of different JA concentrations on POD activity under cold stress

2.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性 如图4 所示，将马铃薯植株进行JA 处理24 h 后，与蒸馏水对照（SOD 活性为166.32 U/g）相比，50 μmol/L JA 处理的SOD 活性（151.52 U/g）没有发生显著变化，而100 μmol/L JA 处理后SOD 活性（108.61 U/g）降低35%，200、400 μmol/L JA 处理后SOD活性分别降低70.7%（SOD 活性为48.67 U/g）和61.4%（SOD 活性为64.12 U/g）；低温胁迫处理4 h 后，与对照相比，50 μmol/L JA 处理的SOD 活性没有发生显著变化，但100 μmol/L JA 处理后SOD 酶活性增强32.8%，200、400 μmol/L JA 处理后SOD 活性分别增强64.4%和112.6%。表明在正常条件下JA 处理抑制了SOD 活性，且以200 μmol/L 效果最显著，而在低温胁迫处理后，SOD活性随着JA 浓度的增加而增强。

图4 不同JA 浓度处理对低温胁迫条件下SOD 活性的影响Fig.4 Effects of different JA concentrations on SOD activity under cold stress

2.3 JA 对马铃薯CBF 基因表达的影响

如图5 所示，马铃薯植株经JA 和低温胁迫处理后，检测JA 响应Marker 基因MYC2的表达，结果发现，在正常条件下JA 处理促进了MYC2 基因的表达，并且在100 μmol/L JA 处理后达到峰值，为对照的4.3 倍；进一步进行低温胁迫处理4 h，MYC2 的表达与0 h 相比均有显著地增强，其中100、200、400 μmol/L JA 处理分别比对照增强2.17、2.28、2.31 倍，表明JA 处理结果是可靠的。随后分别对马铃薯CBF1、CBF2和CBF3的表达进行分析，结果（图5）显示，JA 处理24 h 后诱导3个CBF基因的表达，其中CBF1基因的表达在100 μmol/L JA 处理后达到最强，CBF2基因的表达在200 μmol/L JA 处理后最高，CBF3基因则在400 μmol/L JA 处理后效果最好；进一步的低温胁迫处理4 h 后，发现3 个CBF基因的表达与0 h 对比均有显著诱导，与对照相比，CBF1、CBF2、CBF3基因的表达在分别在50、100 μmol/L JA 处理后效果最好。表明JA 处理能够增强抗寒关键基因CBF的表达，进一步提升马铃薯的抗寒性。

图5 不同JA 浓度处理及低温胁迫对StCBFs 基因表达的影响Fig.5 Effects of different JA concentrations on the expression of StCBFs under cold stress

3 讨论

低温是限制植物生长、种群地理分布和农艺性状的重要环境因子［27］。许多植物已经进化出适应低温气候的能力，并表现出局部的适应性状［28］。低温胁迫会诱导植物产生大量的活性氧（ROS），进而造成植物膜脂过氧化，细胞膜系统损伤，甚至细胞死亡，最终会影响植物的正常生长［29］。在许多植物中已经有研究表明，JA 参与调节ROS 的平衡机制，并且是通过影响ROS清除酶的活性实现的。本研究以马铃薯植株为研究对象，通过监测不同浓度JA 对低温胁迫条件下马铃薯植株ROS 清除酶活性的影响，筛选提升马铃薯植株抗寒性最适的JA 浓度，旨在为实践生产中应用JA 提供一定参考。本研究发现，随着JA 处理浓度的提升，马铃薯叶片中过氧化氢的含量显著降低，并且以200 μmol/L JA 处理效果最明显，而低温胁迫处理后各处理的过氧化氢含量均显著增加，但100、200、400 μmol/L JA处理的过氧化氢含量显著低于对照，表明JA 能够显著抑制过氧化氢的积累。同样地，进一步分析ROS 清除机制中的3 种酶的活性，发现100、200 μmol/L JA 处理后CAT、POD 活性显著升高，表明JA 通过调节CAT 和P OD 活性［30］来调节马铃薯叶片细胞内ROS 的平衡，进而影响抗寒性；然而，SOD 活性在常温和低温胁迫条件下呈现出相反的趋势，这可能是由于常温条件下JA 促进CAT 和POD 活性降低了过氧化氢的含量，进而导致SOD 活性维持在较低水平，而在低温胁迫下过氧化氢含量显著升高，促进了SOD 活性提升，且此时JA 起着正调节的作用［30-31］。

CBF家族基因是植物响应低温胁迫的关键转录因子［23，32-33］。研究发现，在许多植物中，低温胁迫能够激活CBF1-3的积累，并激活其下游COR（Cold-related）基因的表达，以提升植物的抗寒性［24,34］。JA 能够正调节ICE-CBF 信号途径，增强植物的抗寒性［35］。本研究发现，在马铃薯中，JA 处理能够诱导JA 信号Marker 基因MYC2的表达，表明JA 处理结果可靠；进一步对CBF1-3的表达进行分析表明，JA 处理能够促进CBF1-3的表达，以100、200 μmol/L JA 处理效果最为显著。经低温胁迫处理后，与正常条件相比，3 个CBF基因的表达均被诱导上调，以50、100 μmol/L JA处理表达最高，且CBF2变化倍数最高达500多倍，可能作为主效基因，其次为CBF1和CBF3。其原因可能是低温胁迫促进了内源JA 的积累［29］，从而促进了CBF1-3基因的表达。

4 结论

本研究结果表明，低温胁迫条件下外源JA处理能够提升马铃薯叶片活性氧清除酶CAT、SOD 和POD 活性，抑制活性氧的积累，提升马铃薯的低温胁迫耐性，并且在一定范围内（0～400 μmol/L）随着JA 浓度的增加ROS 清除酶的活性呈现出增强的趋势；马铃薯适宜的茉莉酸处理浓度范围为100～400 μmol/L，其中以200 μmol/L 效果最佳，此时能够将活性氧清除酶CAT、POD 和SOD 活性分别提升30%、153%和64%，活性氧含量降低47.6%。此外，外源施加JA 能够显著促进抗寒关键基因StCBFs的表达，提升马铃薯的抗寒性，在实际生产中遭遇低温寒潮时，可适当施用JA，减少损失。