烟草种质资源重要活性成分含量差异研究

邵秀红，马柱文，袁清华，李集勤，潘晓英，黄振瑞

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室/广东省烟草育种与综合利用工程技术研究中心，广东 广州 510640）

【研究意义】烟草（Nicotiana tabacumL.）是世界上重要的经济作物，作为卷烟工业原料的同时，其药用价值备受关注。烟草中含有绿原酸、芦丁（亦称芸香苷）、茄尼醇等多种活性成分，其中绿原酸具有抗肺炎链球菌、金葡球菌和痢疾志贺氏菌等细菌，抗艾滋病、甲型流感、乙型肝炎等病毒，抗肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤等肿瘤，治疗血脂异常、糖尿病、高血压等代谢性疾病等多种药理作用［1-2］；芦丁可以有效清除自由基、抗脂质过氧化、抗病毒、拮抗血小板活化因子、抗急性胰腺炎等；茄尼醇是合成辅酶Q10 和维生素K2 的主要中间体，还可以作为抗溃疡药物、抗癌药物的合成原料［3-4］。广东省农业科学院作物研究所于20 世纪50 年代开始烟草种质资源的收集工作，目前保存各类烟草资源约1 300份，其中包括广东地方特有资源300 多份，这些烟草资源在本地保存后绿原酸、芦丁、茄尼醇等重要活性成分的含量变化尚不清晰。因此，明确各活性成分的含量差异，对于开发利用这些烟草资源具有重要的现实意义。【前人研究进展】绿原酸和芦丁都是多酚类化合物，在烟草中的含量较高，占烟草中植物多酚含量的80%以上［5］。植物中广泛存在的绿原酸类物质有6 种异构体，即绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C，这些异构体都具有一定的生物活性［6］。史春云等［7］测定了不同产地上部烟叶中8 种多酚物质的含量，结果表明烟叶中含量较高的是绿原酸和芸香苷，且不同产地的多酚含量差异较大，其中以河南襄县的绿原酸含量最高。李力等［8］分析了不同来源的18 个烤烟样品中6 种多酚的含量，发现从高到低依次为绿原酸、芸香苷、隐绿原酸、新绿原酸、莰菲醇基-3-芸香糖苷、莨菪亭。万诚等［9］的研究结果显示，在烟草整个生育期，烟叶中绿原酸呈4 种变化趋势，分别为上升、上升—下降—上升、“M”和“W”型变化趋势；其中在烟叶成熟采收时，烤烟类与香料烟类品种的绿原酸含量最高、为2.3%，其次是晾晒烟，白肋烟最低、为1.4%。这些研究表明，在不同产地、不同类型、不同生育期的烟草中，绿原酸、芦丁等的含量有较大差异。茄尼醇是一种萜烯类化合物，在烟叶、马铃薯叶和桑叶中含量突出，尤其在烟叶中茄尼醇含量可高达0.3%～3%［10］。Kotipalli 等［11］对茄科植物中提取的茄尼醇进行测定，证实了烟草是茄尼醇最丰富的来源（0.85%～3.75%）。刘宇欣等［12］的研究表明，白肋烟及烤烟中茄尼醇含量较高，香料烟其次，而雪茄烟含量最低。同一类型烟草品种在不同的取样时期，茄尼醇的含量均以叶中最高，其次是茎，根中最低［13］，且烟草不同叶位茄尼醇含量的顺序为上部叶＞中部叶＞下部叶［14-15］。不同生长期的云烟85 和漂河1 号烟叶中茄尼醇含量随着烟株苗龄的增加而逐渐上升，现蕾时叶中的茄尼醇含量达到最大值，此后逐渐下降，并趋于平缓［16］。也有一些关于不同产区烟草茄尼醇含量变化的报道［12,15,17-18］。以上研究表明，茄尼醇在烟草中的含量最高，不同类型、不同组织、不同叶位、不同生育期以及不同产区的烟草中，茄尼醇的含量也有较大差异。【本研究切入点】广东省农业科学院作物研究所目前保存烟草种质资源约1 300 份，是我国烟草资源的主要保存单位［19］，由于烟草资源主要以种子形态在特定环境中进行保存，一定时间后种子发芽率逐渐下降，因此需要按计划分年度进行繁种更新，以保证烟草种质的长期保存［20］。繁种用烟草种质资源中各活性成分含量亟需明确，而前人的研究多是检测打顶后烟草各成分的含量［21-23］，不打顶条件下含量变化尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】利用HPLC方法检测繁种用烟草种质资源中绿原酸、芦丁、茄尼醇等重要活性成分的含量，以期为所保存烟草种质资源的有效开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在广东省农业科学院白云基地进行，试验地肥力中等，前作为水稻。供试17 份烟草种质资源材料包括K326、云烟87、翠碧一号、广 烟125、广 烟127、NC82、NC347、CV099、SR1307、黄 坑7 号-1、黄坑片坑3 号等11 份烤烟和S20 大牛舌、S19 大肩叶、S18 大幅烟、S21 大秋根-2、S17 大都青梗、S16 打宾柳叶烟等6 份晒烟，于2020 年7 月10 日播种育苗，9月1 日移栽，采用大田常规栽培管理，烟株现蕾后不打顶，在叶片成熟期采收上二棚叶片，每份资源采收3 株，每株采1～2 片叶，105 ℃杀青30 min，然后去掉各叶片的主脉，再于55 ℃烘箱中烘干备用。

仪器：高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国），超声波清洗器（KQ-250DE，江苏昆山），电子天平（Mettler Toledo EL204，德国），高速冷冻离心机（Thermo Scientific SL16R，美国），超纯水器（Millipore Direct-Q，美国），多功能粉碎机（FW100，天津）。

试剂：甲醇、乙醇、乙腈、甲酸和磷酸二氢钠均为Sigma Aldrich 品牌，HPLC 级别。绿原酸（Chlorogenic acid）、新绿原酸（Neochlorogenic acid）、隐绿原酸（Cryptochlorogenic acid）、异绿原酸A（Isochlorogenic acid A）、异绿原酸B（Isochlorogenic acid B）、异绿原酸C（Isochlorogenic acid C）、芦丁（Rutin）和茄尼醇（Solanesol）等分析标准品，纯度均≥98 %，购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制 分别精确称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 标准品各10 mg，分别定容于200 mL 容量瓶中，配制成50 μg/mL 的母液，然后等梯度分别稀释成50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μg/mL 标准品溶液，测定分析曲线。

准确称量芦丁和茄尼醇标准品各10 mg，分别定容于10 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的母液，然后等梯度分别稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125 mg/mL 的标准品溶液，测定分析曲线。

1.2.2 样品制备 将烘干的烟叶用多功能粉碎机进行粉碎，过孔径0.425 mm 筛备用。称取0.1 g左右的烟末样品于2 mL 离心管，加入1.0 mL 提取液，在30 ℃、超声提取20 min，重复3 次；浸提液以10 000 r/min 离心10 min，将上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，然后将稀释后的样品进行HPLC分析。6种绿原酸异构体的提取液为50%的甲醇，芦丁和茄尼醇的提取液为纯甲醇。

1.2.3 HPLC 分析 色谱条件：色谱柱为VPODS（Shim-pack，5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温为35 ℃，紫外检测器为Agilent 1260 VWD。

（1）6 种绿原酸异构体的测定。流动相A（0.1%甲酸）：B（乙腈），流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长327 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Progress of gradient elution

（2）芦丁的测定。流动相A（0.1%磷酸二氢钠）：B（乙腈）=68:32，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长275 nm。

（3）茄尼醇的测定。流动相A（乙醇）：B（甲醇）=72:28，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长215 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件确定

为了准确区分6 种绿原酸异构体，利用HPLC 法进行检测，并参照董珊等［24］的方法，以0.1%甲酸和乙腈为流动相，进行梯度洗脱，利用1260 VWD 检测器，检测波长选择327 nm，6 种化合物可得到良好的分离（图1）。芦丁的检测以0.1%磷酸二氢钠和乙腈为流动相，检测波长选择275 nm。茄尼醇检测的流动相是乙醇和甲醇，检测波长为215 nm。柱温选择35 ℃，该温度下8种化合物的分离效果良好。

2.2 线性关系分析

以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程，结果（表2）显示，6 种绿原酸异构体在12.5～0.40 μg/mL 范围内线性关系良好，检出限为1.1～1.5 mg/kg，定量限为3.7～5.0 mg/kg；芦丁、茄尼醇分别在1.0～0.03125、0.5～0.03125 mg/mL 范围内线性关系良好。图1～图3 分别为6 种绿原酸异构体、芦丁和茄尼醇标准品的HPLC 色谱图，其中6 种绿原酸异构体的保留时间为7.637～17.468 min，芦丁、茄尼醇的保留时间分别为7.289 和7.370 min。

图1 6 种绿原酸异构体标准品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of six chlorogenic acid isomer standards

图2 芦丁标准品的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard

图3 茄尼醇标准品的HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of solanesol standard

表2 8 种化合物的回归方程和相关系数Table 2 Regression equations and correlation coefficients of 8 compounds

2.3 6 种绿原酸异构体含量分析

从图4 可以看出，6 种绿原酸异构体中，新绿原酸以S16 打宾柳叶烟的含量最高（215.91 mg/kg），其次是NC347、NC82（分别为189.96、162.18 mg/kg），而K326 最低（未检测到）；含量高于100 mg/kg 的种质有8 份，其中烤烟和晒烟种质各4 份，分别占所测种质的36.4%和66.7%。绿原酸的含量如图5 所示，以S16 打宾柳叶烟最高（4 813.41 mg/kg），其次是S20 大牛舌、S19 大肩叶（分别为2 475.67、2 081.68 mg/kg），而K326 最低（47.43 mg/kg）；含量高于1 000 mg/kg 的种质有9 份，其中烤烟5 份，晒烟4 份，分别占所测种质的45.5%和66.7%。隐绿原酸的含量如图6 所示，也是以S16 打宾柳叶烟最高（670.13 mg/kg），其次是S19 大肩叶、S20 大牛舌（分别为425.63、311.53 mg/kg），而K326 最低（未检测到）；含量高于200 mg/kg 的种质有9 份，其中烤烟5 份，晒烟4 份，分别占所测种质的45.5%和66.7%。以上结果表明，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸含量较高的晒烟类烟草种质数占比均较高，烤烟类不同烟草种质中这3 种活性成分的含量差异较大。

图4 17 份烟草种质的新绿原酸含量Fig.4 Content of neochlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

图5 17 份烟草种质的绿原酸含量Fig.5 Content of chlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

图6 17 份烟草种质的隐绿原酸含量Fig.6 Content of cryptochlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

异绿原酸B的含量如图7所示，在8份烟草种质中检测到，均为烤烟，占所测种质的72.7%，以广烟127的含量最高（108.68 mg/kg），其次是NC82、K326，均低于100 mg/kg，另外9份种质中未检测到，其中包括3份烤烟和6份晒烟；异绿原酸A的含量如图8所示，17份烟草种质的含量均低于10 mg/kg，其中以NC82最高（9.89 mg/kg），其次是NC347、S21大秋根-2，除广烟125和黄坑7号-1烤烟种质中未检测到外，全部晒烟以及9份烤烟种质中均有检测到；异绿原酸C的含量如图9所示，17份烟草种质的含量均低于20 mg/kg，以广烟127含量最高（19.80 mg/kg），其次是CV099、S20 大牛舌，全部晒烟以及9份烤烟种质中均有检测到，与异绿原酸A相似，只有广烟125和黄坑7号-1烤烟种质中未检测到。以上结果表明，异绿原酸B在所选6份晒烟烟草种质中均未检测到，广烟125和黄坑7号-1烤烟中均未检测到异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C，17份烟草种质中这3种活性成分的含量与前3种相比，大多较低。

图7 17 份烟草种质的异绿原酸B 含量Fig.7 Content of isochlorogenic acid B in 17 tobacco germplasms

图8 17 份烟草种质的异绿原酸A 含量Fig.8 Content of isochlorogenic acid A in 17 tobacco germplasms

图9 17 份烟草种质的异绿原酸C 含量Fig.9 Content of isochlorogenic acid C in 17 tobacco germplasms

综上可以看出，绿原酸是6 种异构体中含量最高的，在17 份烟草种质中均有检测到，其次是隐绿原酸和新绿原酸，而异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 的含量总体偏低，其中异绿原酸A 和异绿原酸C 在15 份种质中均有检测到，异绿原酸B 在多数烤烟种质中检测到，但在全部晒烟中均未检测到。

2.4 芦丁含量分析

如图10 所示，芦丁以NC347 烤烟的含量最高（46.456 g/kg），其次是S19 大肩叶（7.782 g/kg）和S17 大都青梗晒烟（6.250 g/kg），而云烟87 烤烟最低（1.206 g/kg）；含量高于3 g/kg的烤烟和晒烟种质分别有3 份和6 份，分别占27.3%和100%。可见，不同烤烟种质中芦丁的含量差异较大，含量范围为1.206～46.456 g/kg，而不同晒烟种质中芦丁的含量差异比烤烟稍小，为3.269～7.782 g/kg。

图10 17 份烟草种质的芦丁含量Fig.10 Content of rutin in 17 tobacco germplasms

2.5 茄尼醇含量分析

如图11 所示，茄尼醇以NC347 烤烟中的含量最高（44.913 g/kg），其次是K326 烤烟（11.140 g/kg）、S17 大都青梗晒烟（9.844 g/kg），而黄坑7 号-1 烤烟中最低（2.793 g/kg）。含量高于3 g/kg 的烤烟和晒烟种质分别有9 份和5 份，分别占所测资源的81.8%和83.3%。可见，不同烤烟种质中茄尼醇的含量差异较大，含量范围为2.793～44.913 g/kg，而不同晒烟资源中茄尼醇的含量差异也相对较小，为2.857～9.844 g/kg。

图11 17 份烟草种质的茄尼醇含量Fig.11 Content of solanesol in 17 tobacco germplasms

3 讨论

3.1 绿原酸、芦丁的含量差异

绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸生成的缩酚酸，在6 种绿原酸异构体中，绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸均为单咖啡酰奎宁酸，异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 均为二咖啡酰奎宁酸。Meinhart 等［25］分析了巴西100 种商业化种植植物中6 种绿原酸异构体的含量，其中绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸分别在66、63、52 种植物中检测出，而异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 分别在55、48、48 种植物中检测出。该研究表明，绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸在多数植物中都能检测到，但也有多种植物检测不到异绿原酸B 和异绿原酸C，与本研究结果相似。在咖啡中，3 种单咖啡酰奎宁酸的浓度相对较高［26］，单咖啡酰奎宁酸约占生咖啡豆质量的10%［27］，其中以绿原酸的含量最为丰富［6］。咖啡和金银花是绿原酸异构体含量均较高的两种植物。董珊等［24］的研究表明，咖啡和金银花中6 种绿原酸异构体的含量均相对较高，其中金银花以绿原酸含量最高、为1.94×104mg/kg，其次是异绿原酸A 和异绿原酸C，分别为6.42×103、2.00×103mg/kg；咖啡中绿原酸和隐绿原酸含量接近，分别为8.34×103和8.48×103mg/kg，其次是新绿原酸、为4.99×103mg/kg。马跃新等［28］发现滇金银花中绿原酸含量为24.79～34.01 mg/g。在烟草中，绿原酸含量与烟草的香气密切相关，因而与烟草及其制品的等级呈正相关，绿原酸含量高的烟叶及卷烟质量越好；绿原酸还对烟草的生长发育、烟叶颜色以及烟株抗病虫害、抗寒及其他逆境等方面有着重要影响［9,29］。欧阳璐斯等［30］研究发现，烟草中14种多酚类化合物的含量差异较大，以绿原酸的含量最高、为3 828.3～9 251.6 mg/kg，新绿原酸、隐绿原酸含量分别为794.8～1 628.9、1 215.7～2 505.2 mg/kg。本研究结果表明，绿原酸在其6 种异构体中含量最高，这与史春云等［7］、李力等［8］、Magaña 等［6］、欧阳璐斯等［30］的研究结果一致；其次是隐绿原酸和新绿原酸，与李力等［8］的研究结果一致。本研究中，17 份烟草种质中K326 烤烟的绿原酸含量最低，这与万诚等［9］的研究结果即烤烟类型品种K326 的绿原酸含量最高（28.544 mg/g）相差较大，这种差异可能主要与各烟草种质在现蕾后未打顶有关，烟草在现蕾后转入生殖生长，消耗较多的营养，造成烟叶品质下降，而绿原酸含量与改善烟叶等级密切相关［31］。

芦丁和绿原酸同属于多酚类化合物，前人的研究中通常同时检测两种化合物。史春云等［7］、李力等［8］和欧阳璐斯等［30］的研究结果显示，烟草多酚类物质中，芦丁的含量仅次于绿原酸，含量范围分别为5.73～14.88、2.61～7.87、2 825.9～6 412.6 mg/kg。本研究中，NC347 烤烟中芦丁的含量最高，比史春云等［7］报道的最高含量高约32 g/kg，其他16 份烟草种质的含量范围与欧阳璐斯等［30］和李力等［8］的结果趋于一致。然而，本研究中芦丁与绿原酸的含量相比整体偏高，这与前人研究报道有较大差异。也有其他作物中芦丁含量比较高的报道，如Vollmannová 等［32］研究了不同荞麦品种叶片中芦丁、牡荆素、槲皮素、山奈酚等化合物的含量，其中芦丁的含量最高，为17.742～31.069 mg/g，含量最高的荞麦品种Kasho-2 与NC347 烤烟较接近。

3.2 茄尼醇的含量差异

茄尼醇是烟草石油醚、环己烷提取物的主要组成成分。烟草石油醚、环己烷提取物被认为是烟草香气成分的重要来源，也是烟气有害成分的贡献者，是烟叶质量评价的主要指标［15］。根据前人的研究报道，烟草中茄尼醇的含量为0.3%～4.13%［10-11,18］。本研究中，NC347 烤烟中茄尼醇的含量最高，质量分数为4.49%，比前人报道的4.13%高0.36%，该种质在资源鉴评方面值得深入研究；其他16 份烟草种质的质量分数为0.28%～1.11%，与前人的结果基本一致。本研究11 份烤烟和6 份晒烟种质中，茄尼醇含量高于5 g/kg 的分别有6 份和3 份，说明所测烤烟类种质的茄尼醇含量较高，与刘宇欣等［12］的结果类似，而且与所测种质绿原酸的含量相比也整体偏高。

4 结论

本研究17 份繁种用烟草种质资源中，芦丁和茄尼醇的含量与绿原酸相比总体较高，且均以NC347 烤烟的含量最高，质量分数分别为4.65%和4.49%，该种质值得进一步研究，可以作为芦丁和茄尼醇开发利用的候选种质。绿原酸在其6种异构体中含量最高，且以S16 打宾柳叶烟晒烟最高、为0.48 %，但17 份烟草种质的绿原酸含量与前人报道的结果相差较大，由于这些种质在现蕾后未打顶，可能对绿原酸有较大的影响，下一步需要明确打顶与不打顶条件下各种质中绿原酸的差异。