广东晒烟大叶密合受青枯病菌侵染后差异表达蛋白分析

马柱文，屈玉娇，潘晓英，陈俊标，张振臣，李集勤，黄振瑞，袁清华

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室/广东省烟草育种与综合利用工程技术研究中心，广东 广州 510640）

【研究意义】烟草青枯病是由雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传细菌性病害，常暴发流行于热带和亚热带地区［1］。病菌通常由开放性伤口入侵，有些情况下也从主根发生侧根时产生的自然开口入侵，入侵后病菌进入木质部，迅速耗尽木质部的氧气并堵塞导管使水分运输受阻［2］，维管组织及木质部变色，叶片枯萎，烟株凋亡［3］。该菌宿主范围极广，除烟草外，茄子、番茄、马铃薯等其他茄科作物均可侵染为害［4-5］。【前人研究进展】随着分子生物学的发展，尤其是转录组和蛋白组学等技术的广泛应用，人们对植物响应病原菌的入侵有了更深入的了解［6］。Chen 等［7］对抗、感两个茄子品种接种青枯病菌后的转录组分析显示，大部分差异表达基因属于生物过程类别，其中代谢过程和细胞过程的基因数目最多。接种青枯病菌后抗、感两个品种的差异表达蛋白中有85 个属于免疫应答蛋白。Prasath等［8］对抗、感两个生姜品种接种青枯病菌后的转录组分析鉴定出抗性品种105 个基因在接种之后表达量上调，其中包含直接参与通过水杨酸（SA）介导的超敏反应、系统性获得和细胞凋亡反应抵御病原菌的重要基因。利用双向电泳和质谱分析技术，Park 等［9］发现马铃薯青枯病抗性品种CT206-10 中富甘氨酸RNA 结合蛋白（Glycinerich RNA binding protein，GRP）、番茄胁迫诱导-1蛋白（Tomato stress induced-1 protein，TSI-1）、发病相关（Pathogenesis-related，STH-2）蛋白等8 个响应青枯病菌入侵的差异蛋白。利用相同技术，Afroz 等［10］从青枯病菌接种番茄抗、感两个品种中鉴定出9 个差异表达蛋白，与感病品种相比，其中的60 ku 伴侣蛋白和Rubisco 活化酶在抗性品种中显著上调。【本研究切入点】大叶密合是广东封开县主栽晒烟品种，为名优晾晒烟品种之一，对青枯病具有较强且稳定的抗性［11-13］。SSR 遗传图谱分析显示大叶密合的6 个QTL 不同于已经发现的抗源［14］。【拟解决的关键问题】利用同位素相对和绝对定量标记（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）方法研究大叶密合接种青枯病菌后的蛋白质表达量变化，旨在探寻与抗青枯病相关的功能蛋白及代谢途径，为烟草抗青枯病分子机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为大叶密合、D101（抗病对照品种）和长脖黄（感病对照品种），均来源于广东省农业科学院作物研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理及采集 2019 年7 月15 日播种，人工气候箱中培养，培养条件为温度27 ℃、湿度80%、光照强度12 000 lx。烟苗生长至具有6 片真叶成苗期时，采用伤根灌菌法接种青枯病菌。试验设置高致病力菌株203（生化型Ⅲ）、低致病力菌株204（生化型亚型Ⅲ-1）［15］以及无菌水处理3 个处理，每个处理3 个重复，每个重复种植12 株，每株淋灌150 mL 细菌悬浮液，浓度为3.9×108CFU/mL，分别在接菌处理0、3、6、9、

12 h 取新鲜叶片用于RNA 表达量分析，取样部位为成苗期最长叶（第5 片叶）。感病对照品种长脖黄茎基部出现发病症状时，剪取新鲜叶片用于差异蛋白分析，接菌后5、10、15、20 d 调查发病率及病情指数。

1.2.2 差异表达蛋白分析 将新鲜烟叶样品用酚抽提法提取蛋白，用裂解液溶解蛋白后再进行超声裂解，蛋白裂解液用DTT 还原处理后进行半胱氨酸的烷基化封闭，再加入丙酮-20℃过夜沉淀蛋白，蛋白沉淀在TEAB 中再次超声裂解后取上清用于定量。定量的蛋白加入胰蛋白酶消化后真空离心干燥，进行iRATQ 标记，每组样品对应一个分子质量（iTRAQ113-大叶密合接种后、iTRAQ114-大叶密合接种前）。标记后各组肽段混合，用SCX 进行液相分离，MS/MS 鉴定。每个样本设定两次上机重复。蛋白鉴定结果 经MASCOTT2.2 搜索Nicotiana benthamiana、Nicotiana sylvestris、Nicotiana tabacum等3 个 物种的整合数据库进行统计分析，当蛋白丰度比（即差异倍数）达到1.5 倍以上且经统计检验其P值小于0.05 时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白，差异蛋白进行GO 分析和Pathway 富集分析。

1.2.3 烟草凝集素基因转录水平分析 采用Trizol法提取新鲜烟草叶片RNA，采用微量紫外分光光度计测定RNA 浓度，采用琼脂糖电泳技术测定RNA纯度和完整度，用反转录试剂盒（Invitrogen 公司）进行cDNA 合成，反转录引物混合使用随机引物和Oligo（dT）。使 用Fast SYBR®Green Master Mix Bulk Pack 试剂盒公司荧光定量扩增烟草凝集素基因Nictaba，以actin为内参。actin引物序列：actinf：5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′；actinr：5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′，Nictaba引物序列：Nictabaf：5′-AGGGTAGCTTGGCTTGAC-3′；nictabar：5′-TCTTAGCGATGCTGTGGC-3′，扩增产物进行琼脂糖电泳确认。以2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 病情指数分析

由表1 可知，接入高致病力菌株203（生化型Ⅲ）后，感病对照品种长脖黄最先出现植株枯萎症状，抗病对照品种D101 于接菌后5 d 出现植株枯萎症状，大叶密合于接菌后10 d 出现植株枯萎症状。大叶密合的青枯病抗性表现优于抗病对照品种D101。参试品种接入低致病力菌株204（生化型亚型Ⅲ-1），植株发病程度有所减缓，这与菌株致病力高度相关。接菌处理20 d 后，参试品种发病率均达75%以上，感病对照品种长脖黄发病率接近100%。

表1 参试品种接种青枯病菌后发病情况Table 1 Incidence of tested varieties after inoculation with Ralstonia solanacearum

2.2 蛋白质信息鉴定

由图1 可知，成功鉴定的有定量信息的蛋白共有1 312 个，其中共有蛋白1 277 个。GO 注释包含描述基因的分子功能（Molecular function）、所处的细胞位置（Cellular component）、参与的生物过程（Biological process）。对总蛋白进行GO注释，鉴定到的蛋白在生物过程中占比较大条目为代谢过程（Metabolic process，26.55%）和细胞过程（Cellular process，24.09%），在分子功能中催化（Catalytic，41.03%）和结合（Binding，46.4%）占多数，而细胞组分中主要条目为细胞（Cell，25.51%）和细胞部分（Cell part，25.51%）。

图1 GO 注释分析Fig.1 GO annotation analysis

2.3 COG 功能分析

蛋白相邻类的聚簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG）是对蛋白质进行直系同源分类的数据库。构成每个COG 的蛋白均被假定为来自同一个祖先蛋白，且为Orthologs 或Paralogs。Orthologs 指来自于不同物种的由垂直家系（物种形成）进化而来的蛋白，且特异地保留与原始蛋白相同的功能。Paralogs 指在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。对鉴定蛋白进行分类，翻译后的修饰、蛋白周转、分子伴侣（Posttranslational modification,protein turnover,chaperones）蛋白数量最多，其次是整体功能类（General function prediction only），RNA 加工与修饰类（RNA processing and modification）数量最少，具体如图2 所示。

图2 表达蛋白COG 功能分类Fig.2 Classification of COG function of expressed proteins

2.4 接种青枯病菌后差异表达蛋白分析

通过蛋白质组学分析，对比接种青枯病菌前后的烟草叶片蛋白表达量，发现35 个差异表达蛋白，其中21 个下调表达、14 个上调表达，共有25 个蛋白参与到植物应对外界刺激反应过程中（表2）。上调程度最大的蛋白为Hav1，属于烟草凝集素家族。现已在普通烟草不同品种中发现Hav1 的同源基因有sam1、sam2、sam3、sam4、hav1、hav2、wis、xan和by-2。这些凝集素基因高度保守，由165 个氨基酸编码的蛋白在7 类氨基酸的位置上有差异。

表2 利用iTRAQ 技术在烟草叶片中鉴定到的差异表达蛋白Table 2 Differentially expressed proteins in tobacco leaves identified by iTRAQ

2.5 接种青枯病菌后烟草凝集素表达量变化

以烟草actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR 检测烟草凝集素基因在抗病和感病两个烟草品种分别接种致病和低致病青枯病菌后的相对表达量。由于烟草凝集素家族基因的高度保守性，扩增片段包括该家族中的所有基因。接种致病与非致病青枯病菌后烟草凝集素在两个烟草品种中的表达量均呈现先上升后下降的趋势（图3），其中大叶密合烟草凝集素表达量的上升程度较长脖黄更高。长脖黄烟草凝集素的表达量在接种非致病菌后6 h 达到最高值，其余处理烟草凝集素表达量均在接菌后9 h 达到最高，接菌后12 h 的表达量较接菌后6 h 和9 h 下降。

图3 参试品种接种青枯病菌后烟草凝集素的表达量Fig.3 Expression of nictaba in tested varietiesafter inoculation with Ralstonia solanacearum

3 讨论

植物免疫激活的两个平行的信号转导途径之一位于叶绿体。叶绿体介导的免疫信号传导会导致叶绿体源的活性氧（ROS）及抵御相关激素（如水杨酸SA、茉莉酸JA）的产生［16］。植物受到胁迫的反应之一是生成ROS，但是大量ROS会损伤细胞结构，因此ROS 的生成和代谢需要依靠氧化还原反应维持在稳定状态。本研究在抗性品种大叶密合中鉴定到在氧化还原平衡调控中起重要作用的5 个蛋白，包括多酚氧化酶、过氧化物酶、α 双加氧酶和2 个硫氧还原蛋白。位于叶绿体中的6 个蛋白在接菌前后发生差异表达：2个硫氧还原蛋白、类囊体腔15 ku 蛋白及丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）表达量降低，5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶和光合系统Ⅰ亚基Ⅶ蛋白表达量升高。由于光合系统的蛋白通常协同表达，呈现相似的表达趋势。Cheng 等［17］发现野火病菌（Pseudomonas syringaepv.tabaci）感染后烟草光合系统Ⅰ的活性下降，同时PsbO 蛋白、D1 蛋白和PsaA 蛋白发生降解。沈喜等［18］调查抗病品种小麦感染条锈病菌后叶绿素含量在0～12 d 内的变化，发现叶绿素在0～3 d 下降，之后呈上升趋势。叶绿体中的PPDK 在接菌后表达量下降，该酶也在光合作用中发挥作用，研究发现该酶活性在烟草受到马铃薯病毒Y 侵染或干旱胁迫时提高。酶活性受翻译后加工的影响，并不一定与酶的丰度直接相关［19］。由于植物受病菌感染后，参与免疫反应的蛋白和RNA 的表达量也处于动态变化中，取样时机对差异蛋白的鉴定及表达丰度有较大影响。茉莉酸及其衍生物在植物多个生物过程尤其是生物胁迫（如病原菌入侵、咀嚼式口器昆虫取食）中发挥作用［20-21］。本研究鉴定到的差异蛋白中上调幅度最大的是凝集素家族成员之一的Hav1。凝集素广泛存在于动物、植物和微生物中，具有至少1 个可以可逆结合特定单糖或寡糖的非催化结构域［22］。凝集素蛋白由于具有细胞与蛋白或细胞与细胞之间的识别特性而参与到多种生物过程中，尤其是在免疫防御中发挥作用［23-24］。本研究调查了烟草凝集素在参试品种接菌后0～12 h 的转录，发现烟草凝集素在接菌处理后9 h达到最高值后开始下降。斜纹夜蛾幼虫对烟草的取食实验表明，烟草凝集素的RNA 在取食10 h后表达量最高，之后略有下降，而蛋白表达量从开始取食后逐步升高，到取食后15 h 达到峰值，之后维持该水平到36 h 调查结束［25-26］，该研究中烟草凝集素的RNA 随时间变化趋势与本研究结果类似。

4 结论

广东晾晒烟品种大叶密合具有良好的青枯病抗性。蛋白质组学分析显示，青枯病菌接种后大叶密合21 个蛋白表达量下调，14 个蛋白表达量上调。其中烟草凝集素蛋白Hav1上调表达量最大，烟草凝集素的转录在接菌后6 h和9 h达到最高值。鉴定到的差异蛋白中，上调幅度最大的是凝集素家族成员之一的Hav1，接种强致病力和无致病力菌株后烟草凝集素呈现类似的表达模式，表明凝集素蛋白可能在对病菌入侵后的上游反应过程中发挥作用。