异甘草酸镁对酒精性肝病大鼠肝组织Nrf2/HO-1信号通路和肝纤维化指标的影响*

张 曼，张晓伟，徐圣秋，郭洪梅

（徐州市第一人民医院药学部，徐州 221000）

酒精性肝病（ALD）是长期大量饮酒引发的慢性肝病，随着我国生活水平的提高，ALD 的发病率也逐年升高[1]。ALD 是一种进行性疾病，病变过程为脂肪变性、脂肪型肝炎、纤维化，最后不可逆进展为肝硬化，严重威胁国民的健康与安全[2]。异甘草酸镁（MgIG）是一种肝细胞胞保护剂，具有抗炎、抗纤维化、改善肝功能等作用，临床应用MgIG 治疗ALD疗效显著，且不良反应较少[3-4]。但MgIG在ALD中的具体作用机制尚不清楚。现阶段，ALD的具体发病机制尚未完全阐明，但普遍认为氧化应激在ALD 发生发展中占据重要地位[5]。核因子2 相关因子/血红素氧合酶（Nrf2/HO-1）信号通路是维持氧化还原平衡的重要途径，其在ALD发生发展中有关键作用[6]。本研究将从Nrf2/HO-1 通路的角度，分析MgIG 在ALD 大鼠中的保护作用，旨在为MgIG 治疗ALD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，雄性，SPF 级别，6～8 周，体质量180～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SCXK（京）2020-0035。大鼠饲养于SPF级动物房中，室内温度为20～24 ℃，相对湿度为50%～60%，适应性喂养3 d 后进行后续实验。

1.2 药品与主要试剂

MgIG 注射液（正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20051942，规格：10 mL：50 mg×2支），丙氨酸转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBil）、甘油三酯（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）生化试剂盒（南京建成生物科技有限公司），层黏蛋白（LN）、透明质酸（HA）和Ⅲ型前胶原肽（PC-Ⅲ）ELISA 试剂盒（美国Biosource），Nrf2、HO-1引物序列由北京阅微基因技术有限公司提供，Nrf2、HO-1 蛋白一抗（美国Abcam）。

1.3 分组、建模及干预

将50 只SD 大鼠随机分为对照组、模型组及MgIG低、中、高剂量组，每组10 只。除对照组外，其他组大鼠给予Liber-DeCarli 酒精液体饲料喂养，喂养6 周后观察肝脂肪变性程度及肝细胞形态变化情况，检验ALD大鼠模型制备情况[6]，对照组以普通饲料喂养。模型大鼠制备成功后，MgIG 低、中、高剂量组分别腹腔注射15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg MgIG，1 次/d，连续注射8 周，对照组和模型组注射等体积生理盐水。

1.4 动物处理

给药结束后，眼眶取血分离血清，置于-20 ℃冰箱冻存，快速取出肝组织，部分固定于多聚甲醛进行病理观察，剩余组织置于液氮罐保存。

1.5 指标测定

1.5.1 肝功能、氧化应激指标及肝组织TG 含量的检测 采用生化试剂盒检测血清ALT、AST、TBil、SOD、MDA、GSH 和肝组织TG 含量，检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作，于酶标仪下检测各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算浓度。

1.5.2 病理切片观察 取新鲜肝组织固定于中性多聚甲醛溶液中过夜，制备肝组织石蜡切片（厚度为4 μm），行常规苏木精－伊红（HE）、Masson染色，显微镜下观察大鼠肝组织病理变化和纤维化程度。

1.5.3 纤维化指标检测 采用酶联免疫吸附法检测肝组织LN、HA和PC-Ⅲ水平，检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作，于酶标仪下检测各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算浓度。

1.5.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA 水平 取肝组织样品添加Trizol 试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，再混合SYBR Green MasterMix进行荧光定量PCR扩增，程序设置为95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，总40个循环。Nrf2上游引物为5’-CTCGCTGGAAAAAGAAGTG-3’，下游为5’-CCGTCCAGGAGTTCAGAGG-3’；HO-1 上游引物为5’-CGTCACTTCGTCAGAGGCCTGC-3’，下游为5’-TCTGGGGTTTCCCTCGGGGTG-3’。采用2-△△CT公式，以GAPDH为内参，计算Nrf2、HO-1 mRNA 的相对表达水平。

1.5.5 蛋白印迹法（Western blotting）检测肝组织中Nrf2、HO-1蛋白的表达 取肝组织样品添加裂解液提取蛋白，测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，再电转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶室温下孵育1 h，封闭PVDF膜上的非特异性位点，再分别加入Nrf2、HO-1、β-actin 蛋白一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔/鼠蛋白二抗（1∶5 000）室温下孵育1 h，抗体结合免疫结束后添加化学发光试剂，进行显影成像，以β-actin 为内参，目的条带与β-actin 条带灰度值比值反映Nrf2、HO-1的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能和TG含量的比较

模型组血清ALT、AST、TBil 及肝组织TG 含量均明显高于对照组（均P＜0.05）；与模型组比较，MgIG 中、高剂量组ALT、AST、TBil 及TG 水平明显降低（均P＜0.05），且MgIG 中、高剂量组ALT、AST、TBil 水平低于MgIG 低剂量组，MgIG 高剂量组TG水平低于MgIG低剂量组（均P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠肝功能和TG含量的比较 ，n=10

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MgIG低剂量组比较，△P＜0.05。

2.2 各组大鼠肝组织病理学观察的结果

HE 染色显示，相较于对照组，模型组肝组织细胞脂肪变性严重，汇管区伴有大量的炎性细胞浸润，小叶内出现不同程度的坏死；MgIG 处理后，肝组织病理损伤减轻，其中MgIG 高剂量组效果最佳。Masson 染色显示，相较于对照组，模型组终末静脉增厚，胶原纤维向窦周隙延伸，汇管区及周围纤维化明显；MgIG处理后纤维化程度明显减轻，以MgIG高剂量组改善明显。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学观察图

2.3 各组大鼠肝组织纤维化指标的比较

模型组肝组织LN、HA 和PC-Ⅲ含量明显高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，MgIG 中、高剂量组LN、HA 和PC-Ⅲ含量明显降低（均P＜0.05），且MgIG 高剂量组LN、HA 水平低于MgIG 中、低剂量组，MgIG 中剂量组LN、HA 水平低于MgIG 低剂量组，MgIG中、高剂量组PC-Ⅲ水平低于MgIG低剂量组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠肝组织纤维化指标的比较 ，n=10

表2 各组大鼠肝组织纤维化指标的比较 ，n=10

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MgIG 低剂量组比较，△P＜0.05；与MgIG 中剂量组比较，▲P＜0.05。

2.4 各组大鼠血清氧化应激指标的比较

模型组血清SOD、GSH 水平明显低于对照组，MDA 水平明显高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，MgIG 中、高剂量组SOD、GSH 水平明显升高，MDA水平明显降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表3。

表3 各组大鼠血清氧化应激指标的比较 ，n=10

表3 各组大鼠血清氧化应激指标的比较 ，n=10

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MgIG 低剂量组比较，△P＜0.05；与MgIG 中剂量组比较，▲P＜0.05。

2.5 各组大鼠肝组织Nrf2、HO-1表达的比较

模型组肝组织Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表达高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，MgIG 中、高剂量组Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表达明显升高（P＜0.05），且MgIG高剂量组Nrf2 mRNA水平高于MgIG剂量组，MgIG中、高剂量组HO-1 mRNA水平高于MgIG 剂量组（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表4、图2。

表4 各组大鼠肝组织Nrf2、HO-1表达的比较 ，n=10

表4 各组大鼠肝组织Nrf2、HO-1表达的比较 ，n=10

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MgIG 低剂量组比较，△P＜0.05；与MgIG中剂量组比较，▲P＜0.05。

图2 大鼠肝组织中Nrf2、HO-1蛋白的表达

3 讨论

本研究通过喂食酒精液体饲料构建ALD模型，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠ALT、AST、TBil 及肝组织TG 含量明显升高，且肝组织病理切片也呈现出典型的肝病特征，表明ALD大鼠模型构建成功。ALT、AST、TBil 是肝脏内重要的功能酶系，是肝功能评价的敏感指标[7]。正常情况下，ALT、AST、TBil 在血清中含量较低，当肝细胞受损时，肝细胞膜通透性增加，ALT、AST、TBil 将由细胞质释放进入血液循环，导致血清水平升高[8]。通过观察大鼠肝功能变化情况：MgIG 处理后，大鼠ALT、AST、TBil水平较模型组降低（P＜0.05），表明MgIG可改善ALD大鼠肝功能，这与MgIG的临床应用效果相符[9]。长期酒精代谢造成肝细胞损伤，会引起肝脏血脂代谢异常，表现出脂肪样变性，导致TG水平升高[10]。本实验中MgIG 各剂量结果表明，MgIG可通过降低肝组织中TG 含量，且肝组织病理学观察结果显示，MgIG组和模型组相比，肝细胞形态及结构均得到明显改善，进一步说明MgIG 具有保肝作用。

人体摄入的酒精大部分均在肝脏中代谢，这个过程中会产生大量的活性氧，引发脂质过氧化链反应，生成具有细胞毒性的终产物MDA，导致氧化应激[11]。正常生理状态下，Nrf2处于非活化状态，并作为目标被蛋白体酶降解，当体内出现氧化应激时，Nrf2将被激活进入细胞核中，与抗氧化反应原件结合，激活下游靶基因HO-1、SOD 等代谢酶，发挥抗氧化作用[12]。GSH 也是体内重要的抗氧化剂，可清除氧自由基[13]。Yang等[14]研究显示，MgIG可通过抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX1）、NOX2和NOX4的表达，减少活性氧的产生，从而预防果糖诱导的肝脏氧化应激损伤。本实验中，模型组抗氧化酶SOD 和GSH 活力下降，脂质过氧化终产物MDA水平升高（P＜0.05），表明ALD大鼠肝损伤与氧化/抗氧化水平失衡有关。干预MgIG 后，SOD 和GSH 水平上升，体内抗氧化能力明显增强，MDA 水平减少，有效阻滞过度的脂质过氧化。同时，RT-qPCR和Western blotting结果显示，与模型组比较，MgIG 组肝组织Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表达明显升高（P＜0.05），提示MgIG 可能通过调控Nrf2/HO-1 信号通路，从而减轻ALD 大鼠的氧化应激。

ALD的治疗中延缓肝纤维化的进程、最大程度预防肝硬化，有重要的临床意义。肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质的沉积，是肝纤维化发生的主要机制[15]。肝脏中细胞外基质的成分以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主，LN 是肝细胞外基质中特有的非胶原性结构蛋白，HA主要有星状细胞合成，可与胶原结构蛋白、蛋白多糖等构成结缔组织，PC-Ⅲ是肝内胶原蛋白增加的主要成分[16]。Sui 等[17]通过四氯化碳诱导肝纤维化大鼠模型，发现MgIG 可抑制肝星状细胞的活化，从而发挥抗纤维化作用。纤维化参数检测发现，MgIG 组大鼠肝组织LN、HA和PC-Ⅲ含量明显低于模型组（P＜0.05），表明MgIG 在ALD 中可能通过改善肝组织纤维化，以保护肝损伤。

综上所述，MgIG 能够改善ALD 大鼠肝组织的病理学改变，改善肝功能，降低TG 含量，可能通过Nrf2/HO-1 途径减轻氧化应激及改善肝纤维化，从而缓解酒精性肝损伤。