桂千金子提取物对金黄色葡萄球菌体外抗菌作用及机制的初步研究*

王鹤龄，谭珍媛，冯钟文，庞丽君，黄瑀莘，陈思韵，韦锦斌△

（1.广西医科大学第一附属医院药学部，南宁 530021；2.广西医科大学药学院，南宁 530021）

桂千金子（Polygonum runcinatumBuch.Ham.）为草本植物药蓼科植物赤胫散的根茎。瑶医以其入药，有清热解毒，活血止痛，解毒消肿之功效，用于治疗急性胃肠炎，月经不调，乳腺炎，痈疖肿毒等[1-3]。疖、痈为急性化脓性感染，病原菌几乎为金黄色葡萄球菌[4]，金黄色葡萄球菌感染往往会局部扩散，引起脓肿和痈肿，若不及时治疗，可能导致严重并发症[5]，而多重耐药菌的出现又会降低用于治疗皮肤感染的抗生素的有效性[6]。

前期研究发现，在10 种常见致病菌中，桂千金子对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用。本实验根据桂千金子的民间用法及文献参考[7-11]，以水提取物、乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取物作为供试药物对金黄色葡萄球菌标准菌株（SA）及临床分离的金黄色葡萄球菌菌株（MSSA）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行体外抗菌实验[12-13]，初步探究临床分离MRSA菌株抗菌作用机制，进一步明确桂千金子的有效抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 药材

瑶药桂千金子于2019 年3 月收采于广西壮族自治区北流市六麻镇，经广西医科大学药学院中药学教研室李琼老师鉴定，确定为蓼科植物赤胫散（Polygonum runcinatum）的干燥根茎。药材自然晾干后粉碎为粗粉，备用。

1.2 待测菌株

SA（CMCC26003）由广西医科大学基础医学院微生物教研室提供。MSSA4431 和MRSA4290 由广西医科大学第一附属医院检验科分离鉴定（全自动微生物鉴定分析系统VIREK 2Compact 60）并提供。

1.3 药品和主要试剂

青霉素药敏纸片（含量：10 μg，批号：20190823）、万古霉素药敏纸片（含量：30 μg，批号：20190823）购自常德比克曼生物科技有限公司；营养琼脂培养基（批号：20190920）购自常德比克曼生物科技有限公司、MH（B）培养基（批号：705G031）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 菌悬液的制备

按无菌操作法[14-15]，将待测菌接种在营养琼脂培养基上，于35 ℃条件下培养，转种活化；取活化后少量待测菌株培养至对数期，挑取适量以0.9%氯化钠注射液调整菌悬液浓度至0.5 麦氏浊度单位，此时浓度约为1.5×108CFU/mL，备用；另取适量稀释至1.5×106CFU/mL，备用。

1.5 桂千金子提取物的制备

1.5.1 水提物的制备 取桂千金子粗粉20 g，加入10 倍量纯水充分浸泡2 h 后，煎煮2 次，每次1 h，合并2 次滤液，水浴蒸干，得水提物7.44 g。取适量水提物以0.9%氯化钠注射液溶解，制成质量浓度为100 mg/mL 的药液，备用。试验前所有药液均用0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.5.2 有机提取物的制备 取桂千金子粗粉20 g，以10 倍量乙醇浸泡过夜，回流提取至无色，抽滤后合并滤液，旋蒸减压，蒸干得乙醇提取物3.78 g，备用；取适量乙醇提取物用纯水溶解后，用乙酸乙酯萃取，旋蒸减压，干燥后得到萃取物0.09 g，剩余水溶液用正丁醇萃取得到萃取物0.19 g，分别用含10%DMSO的0.9%氯化钠注射液溶解，制成质量浓度为100 mg/mL 的药液，备用。试验前所有药液均用0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.6 体外抗菌作用考察

1.6.1 管碟法测定抑菌圈 按无菌操作法，用无菌棉签蘸取待测菌悬液至营养琼脂培养基表面，涂布均匀，将牛津杯等距分散放置，静置10 min 使其固定，精确移取各提取物药液100 μL 至牛津杯中，室温下放置0.5 h 使药液扩散。每个培养基均设置阳性对照组（青霉素药敏纸片、万古霉素药敏纸片）和空白对照组（含10%DMSO 的0.9%氯化钠注射液）。各培养基置于35 ℃生化培养箱培养24 h 后，取出观察并测量抑菌圈直径。抑菌指标判定：抑菌圈直径（IZD）≥15 mm为高度敏感，10≤IZD＜15 mm为中度敏感，5≤IZD＜10 mm 为轻度敏感，IZD＜5 mm为不敏感。IZD越大，表明待测提取物抗菌作用越强[16]。

1.6.2 二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）按无菌操作法，取一次性96 孔板，精确吸取各提取液分别加入200 mL 第1 孔，混匀后吸取100 mL至第2孔，如此连续倍比稀释至第9孔，作为实验组；第10孔作为药液对照组加入菌液和药液；第11 孔作为阳性对照组加入培养基和菌液；第12 孔作为阴性对照组加入培养基；含10%DMSO 的0.9%氯化钠注射液作为空白对照组。将各组置于35 ℃生化培养箱中，培养24 h 后，取出观察菌株生长情况。在黑色背景光源下观察，显示清亮则判定无菌生长，显示浑浊则判定有菌生长，以无菌生长孔所对应的质量浓度为该组的MIC。

分别从上述各组无菌生长孔中吸取培养液100 μL，接种至营养琼脂培养皿中，均匀涂布，培养24 h 后计算平板上的菌落，以活菌计数法表示平均菌落数＜5个对应的最小稀释度的提取物质量浓度为MBC[16]。

1.7 抗菌作用机制考察

1.7.1 碱性磷酸酶（AKP）活性的测定 加入MRSA4290 菌悬液使桂千金子乙醇提取液最终浓度达到4 MIC、1 MIC 和0.5 MIC，以不加桂千金子乙醇提取液的作为空白对照组。将以上培养基置于35 ℃的摇床中培养，每2 h取样，5 000 r/min离心10 min，取上清，酶标仪测定AKP 活性。OD 值越大，表示AKP活性越大，则细胞壁通透性增大。

1.7.2 DNA/RNA 大分子含量测定 方法同“1.7.1项”，以空白对照组作为调零组，用紫外分光光度计在260 nm 处测定吸光度。OD 值越大，表示外流DNA/RNA大分子含量越高，则细胞膜通透性增大。

1.7.3 胞内蛋白质含量测定 方法同“1.7.1项”，将以上培养基置于35 ℃的摇床中培养，每2 h取样，以肉汤培养基调节待测组样品的OD600值一致。取4 mL 菌悬液，离心，以灭菌生理盐水洗涤菌体沉淀3 次后，加入300 μL PBS 缓冲液，100 W 超声1 h，离心，取上清液，酶标仪测定蛋白含量。OD 值越大，表示胞内蛋白质含量越高，则胞内蛋白合成未受抑制。

1.7.4 杀菌曲线的测定 以MRSA4290 菌悬液调节桂千金子乙醇提取液的浓度达到4 MIC、1 MIC和0.5 MIC，以不加乙醇提取液的作为阳性对照组。各培养基置于35 ℃的摇床中培养，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、30 h取样，使用酶标仪测定菌液OD600值，绘制杀菌曲线。OD 值越大，表示菌悬液浓度越高，则MRSA 正常生长未受限制。

1.7.5 细胞形态学观察 以MRSA4290 菌悬液调节桂千金子乙醇提取液的浓度达到4 MIC、1 MIC和0.5 MIC，以不加乙醇提取液的作为空白对照组。各培养基置于35 ℃的摇床中培养，在2 h和6 h取样，5 000 r/min 离心5 min，弃上清液。沉淀经固定、洗脱、喷镀后，在FEI Quattro钨丝灯扫描电镜下扫描观察MRSA4290细胞形态。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计分析软件对实验数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差()表示。组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桂千金子提取物的抑菌活性大小

桂千金子水提物无抑菌圈；乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取物的抑菌圈均≥15 mm，为高度敏感，见表1、图1。

图1 桂千金子提取物抑菌圈直径的测定结果

表1 桂千金子提取物抑菌圈直径的测定结果 mm，，n=3

表1 桂千金子提取物抑菌圈直径的测定结果 mm，，n=3

“—”为未进行试验；“N”为无抑菌圈。

2.2 桂千金子提取物对SA26003、MSSA4431、MRSA4290的MIC和MBC

桂千金子乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物对SA26003、MSSA4431、MRSA4290 的MIC 和MBC分别为1.56 mg/mL和3.13 mg/mL，其正丁醇萃取物的MIC 和MBC 分别为6.25～12.50 mg/mL 和12.50～25.00 mg/mL。MIC 测定结果见表2～表4，MBC 测定结果见表5。

表2 桂千金子提取物对SA26003的MIC测定结果 n＝3

表3 桂千金子提取物对MSSA4431的MIC测定结果 n＝3

表4 桂千金子提取物对MRSA4290的MIC测定结果 n＝3

表5 桂千金子提取物的MBC测定结果 n＝3

2.3 桂千金子乙醇提取物对MRSA4290 的抗菌作用机制

与空白对照组和0.5 MIC实验组比较，4 MIC和1 MIC 实验组的AKP 活性随时间延长而增加，MIC实验组胞外的AKP 活性低于4 MIC 实验组（P＜0.05）；培养基中未检测出DNA/RNA 大分子物质，各实验组OD值与空白对照组比较无明显差异（P＞0.05）；实验中未检测到胞内蛋白含量减少，各实验组OD 值与空白对照组比较无明显差异（P＞0.05）。由阳性对照组绘制的生长曲线可知，MRSA菌在4 h内处于生长适应期，4～14 h 处于生长对数期，14～30 h处于稳定期，与阳性对照组比较，各实验组OD值增加缓慢，4 MIC实验组没有明显的对数生长期，其抑制作用较1 MIC和0.5 MIC实验组更明显（P＜0.05），见图2。

图2 桂千金子乙醇提取物对MRSA4290的作用机制

2.4 细胞形态学观察结果

空白对照组MRSA 菌体在2 h 和6 h 均保有完好的外部形态，光滑呈葡萄串状；0.5 MIC 和1 MIC实验组在6 h 菌体形态发生改变；4 MIC 实验组在2 h菌体形态改变，表面粗糙有少量白点，在6 h菌体粗糙情况更明显，表面出现大量颗粒物附着，细胞体积增大，见图3。

图3 桂千金子乙醇提取物对MRSA4290细胞形态的影响

3 讨论

本实验以桂千金子提取物进行体外抗菌实验，除水提物外，各提取物均具有不同程度的抗菌活性，抗菌强度排序为乙醇提取物≈乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物。在前期药材提取过程中发现，相较于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，乙醇提取物得率较高，出于经济性和时间成本考虑，以桂千金子桂乙醇提取物作为最优实验研究对象，从中进一步分离提纯，寻找桂千金子的有效抗菌活性成分。

桂千金子乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物的抗菌效果相一致，可能与桂千金子的主要成分黄酮类化合物相关[17]，黄酮类化合物在抗菌方面占有显著优势[18]。桂千金子有机提取物均呈酸性，乙酸乙酯萃取物则显示较强的酸性，考虑其可能与桂千金子含有酚酸类化学成分等有关[19-20]，其中没食子酸为一种有机酸，在体外对金黄色葡萄球菌等有抑制作用，该发现为后续深入开展抗菌实验提供了实验基础。

细菌性疾病危及人类健康及公共卫生安全。目前，细菌耐药问题日益凸显，临床上仍以抗生素治疗感染性疾病为主。王梦瑜等[21]在分析近1 300种中药后认为，具备抗菌活性的中药通过有效成分的筛选，可为耐药菌的逆转研究提供参考，在中药中需求新的抗菌药物是解决耐药问题的有效途径之一。本实验研究桂千金子提取物对SA26003、MSSA4431、MRSA4290的抗菌作用，明确了桂千金子对金黄色葡萄球菌切实有效的抗菌活性，且对临床分离MRSA菌株也有具有较好的抗菌效果，进一步对临床分离MRSA菌株进行抗菌作用机制初探，外流AKP活性升高及扫描电镜结果一致表明，桂千金子乙醇提取物可能造成细菌细胞壁结构破损，或导致某种物质外流，影响细菌生长代谢，以上实验结果既验证了桂千金子在民间治疗痈疖之功效，也为临床寻求对抗MRSA有效药物提供了新思路。

本研究为桂千金子在民族瑶药中的开发利用提供了一定的实验依据，而具有抗菌作用的具体有效活性成分及其抗菌机制有待进一步研究。