吲哚乙酸和谷氨酸N,N-二乙酸对Cd-Pb 复合污染土壤上龙葵生长及重金属吸收的影响*

罗 洋，王正霞，向仰州,3，任 军，罗光杰,3，刘 方

（1.贵州师范学院 地理与资源学院，贵州 贵阳 550018；2.贵州大学 资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州师范学院，贵州省流域地理国情监测重点实验室，贵州 贵阳 550018）

土壤重金属污染可影响食品安全、耕地资源、生态环境和经济发展等多个方面，是当前社会关注的热点问题[1]。镉和铅等重金属在环境中可长期蓄积难以清除，污染形势日渐严峻，污染范围逐渐扩大。当重金属积累到一定程度后，不仅会影响农产品的产量和品质，还会对人类赖以生存的生态环境构成巨大威胁。对土壤而言，重金属污染具有停滞性、积蓄性、隐蔽性和不可逆性，且能够通过食物链富集，严重危及人体健康[2]。因此，开展土壤重金属污染修复技术的研究对社会发展和人类健康具有重要意义。

植物修复技术是利用植物自身的特性，通过对重金属的吸收、挥发和固定等过程，促进污染物的去除或毒性降低[3]。目前，在土壤重金属污染植物修复技术中，应用最为广泛的是利用超积累植物从土壤中提取重金属元素，再通过压缩填埋、焚烧、热解和气化等对植物残体进行统一处理[4-5]。其整个修复过程在原位进行，节约成本，具有良好的社会与环境效益。然而，在实际应用中，限制植物对重金属提取效率的主要因素是植物的生物量和土壤重金属的有效性。吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是第1 个被发现的植物生长激素，能调控植物生长发育、促进细胞分裂和伸长，具有提高植物生物量和缓解重金属毒害的作用[6-7]。然而，也有研究证明：超积累植物生物量提高的过程中往往伴随着重金属含量降低，产生“稀释效应”[8]。螯合剂可以促进重金属无效态向有效态转化，增加重金属可溶性，进而提高植物对重金属的富集和提取效率，常被用于强化土壤重金属污染的植物修复研究。当前，谷氨 酸N,N-二 乙 酸（L-glutamic acid N,N-diacetic acid，GLDA）以其绿色环保性和生物可降解性等优点被广泛应用于众多领域[9-10]。有研究表明：GLDA 对土壤重金属的螯合作用和乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）基本一致，但GLDA 的生物可降解性更好，在应用螯合剂活化土壤重金属方面具有很大的发展潜力[11]。但也有研究显示：施用GLDA 有可能会对植物的韧皮部和凯氏带产生毒害作用[12]，限制其生长，进而影响修复效果。鉴于IAA 和GLDA 在诱导植物修复中各有优势和劣势，有学者尝试将两者联合施用探讨其对植物修复的强化效果[13]。

龙葵（Solanum nigrumL.）是茄科一年生草本植物，其重金属耐受力和重金属富集效果突出，且繁殖能力强、生长迅速，被广泛应用于植物修复土壤重金属污染领域[14]。目前用于诱导龙葵修复重金属污染的螯合剂以EDTA 和乙二胺二琥珀酸（ethylenediamine disuccinate，EDDS）居多，选用GLDA 的较少，且缺乏与植物激素联合施用效应的探讨。因此，本研究采用盆栽试验，通过对龙葵生物量、叶片生理指标、地上部Cd 和Pb 含量以及土壤有效态Cd 和Pb 含量的测定，探讨IAA 和GLDA 单独及联合施用对土壤中Cd 和Pb 的影响，以期为重金属污染土壤的修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤：取自贵州省贵阳市乌当区高雁垃圾填埋场周围，土壤类型为石灰土。自然风干挑出杂物后过2 mm 筛备用。土壤样品基本理化性质为：pH 7.84，有机质含量12.86 g/kg，碱解氮含量84.00 mg/kg，有效磷含量57.38 mg/kg，速效钾含量229.23 mg/kg，有效态Cd 含量3.2 mg/kg，有效态Pb 含量531.85 mg/kg。

供试植物：龙葵种子，购于寿光市沃田农业科技有限公司。

供试生长素IAA 购于河南神雨生物有限公司；供试螯合剂GLDA 购于浙江三度化学有限公司。

1.2 试验设计

试验于2020 年5—9 月在贵州师范学院温室大棚进行。共4 个处理，分别为：（1）IAA，施用3 mmol/kg IAA；（2）GLDA，施用10 μmol/kg GLDA；（3）IAA+GLDA，施用3 mmol/kg IAA 和10 μmol/kg GLDA；（4）CK（对照），施用等量蒸馏水。各个处理分别设置4 个重复，每盆装土3 kg。龙葵种子经75% 酒精浸泡30 s 杀菌处理后，用蒸馏水清洗干净，选取颗粒饱满的龙葵种子播种于育苗钵中，置于室温培养，待长出4 片真叶后移栽2 株长势一致的幼苗于花盆中培养。龙葵生长期间均浇灌去离子水，根据天气情况把握浇水频率，保持土壤持水量约为最大含水量的60%，移栽3 个月后收获。IAA 溶液以叶面喷施形式每盆添加10 mL（移栽后第21、28、35 和42 天喷施）；GLDA 溶液在收获前10 d 以滴灌形式滴入龙葵根部，用量为100 mL。收获时龙葵分为地上部和地下部，先用自来水和去离子水清洗干净，晾干后称鲜质量；在105 ℃烘箱中杀青30 min，然后再调整烘箱温度为70 ℃，待其烘干至恒质量后取出用研钵磨碎装袋备用。

1.3 测定项目与方法

龙葵株高用卷尺测量，鲜质量用万分之一天平称量。龙葵叶片叶绿素采用95%乙醇提取，分别于470（类胡萝卜素）、649（叶绿素b）和665 nm（叶绿素a）处测定吸光度并计算其含量；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸显色法测定[15]；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性分别采用氮蓝四唑比色法、愈创木酚和双氧水法测定[16-17]。

龙葵地上部Cd 和Pb 含量的测定：首先，采用HNO3—H2O2消解体系（体积比为5∶2）按120 ℃加热20 min、160 ℃加热20 min 和190 ℃加热40 min 的程序消解，直到液体透明澄清；其次，将消解管置于赶酸仪中，在140 ℃条件下赶酸2.5 h，用1% HNO3将消解液转移至25 mL 容量瓶中并定容；最后用火焰原子吸收光谱仪测定并计算龙葵地上部Cd 和Pb 提取量。龙葵地上部Cd（或Pb）提取量=龙葵地上部干质量×龙葵地上部Cd（或Pb）含量。

土壤有效态Cd 和Pb 含量采用0.1 mol/L HCl浸提，火焰原子吸收光谱仪测定，测定过程通过添加标准物质（GSV 系列）、设置空白和重复样等方式进行质量控制，所用试剂均为优级纯。

1.4 数据处理及分析

采用Microsoft Excel 2019 对试验数据进行整理，用“平均值±标准差”表示；再用IBM SPSS Statistics 26.0 软件进行相关分析和单因素方差分析，并采用LSD 法进行多重比较，差异显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 IAA 和GLDA 对龙葵生长的影响

种植3 个月后，龙葵植株外形如图1 所示，结合表1 可知：IAA 处理组龙葵的长势最好，茎秆粗壮，叶片数量较其他处理多，且排列紧密，株高达60.33 cm；而GLDA 处理组的龙葵茎秆瘦小，叶片稀疏，株高仅为50.50 cm；IAA 与GLDA联用后，龙葵植株较为匀称，整体长势在单施IAA 和单施GLDA 之间，株高为59.75 cm。方差分析结果显示：IAA 处理组以及IAA+GLDA 处理组龙葵的株高相近，且与对照相比未达显著水平（P＞0.05），但均显著高于GLDA 处理组（P＜0.05）；与对照相比，IAA 处理组龙葵的地上部鲜质量显著增加12.87%（P＜0.05），GLDA 处理组则显著降低16.15%（P＜0.05），两者之间的差异也达显著水平（P＜0.05），而IAA+GLDA 处理组的龙葵地上部鲜质量与对照和IAA 处理组无显著差异（P＞0.05），但显著高于GLDA处理组（P＜0.05）。

表1 不同处理条件下龙葵的株高和地上部鲜质量Tab.1 Plant height and shoot fresh weight of Solanum nigrum under different treatments

图1 不同处理条件下的龙葵生长状况Fig.1 Growth status of Solanum nigrum under different treatments

2.2 IAA 和GLDA 对龙葵生理指标的影响

由表2 可知：龙葵叶片的叶绿素a 含量为1.65～1.76 mg/g，叶绿素b 含量为0.65～0.77 mg/g，总叶绿素含量为2.33～2.48 mg/g，且三者在各处理间差异均不显著（P＞0.05）。与对照相比，单施IAA 和IAA+GLDA 联用并未使龙葵叶片丙二醛含量发生明显变化，而GLDA 处理组龙葵叶片丙二醛含量则显著增加20.05%（P＜0.05），也显著高于IAA 处理组和IAA+GLDA 处理组（P＜0.05）。此外，单施GLDA 还使龙葵叶片的SOD、POD 和CAT 活性较对照分别显著降低11.15%、18.52%和14.22%（P＜0.05）；单施IAA 处理组的抗氧化酶与对照相比无显著差异（P＞0.05）；两者联用后，龙葵叶片的SOD 和POD 活性与单施GLDA处理组差异不显著（P＞0.05），但CAT 活性显著增加13.14%（P＜0.05）。

表2 不同处理条件下龙葵叶片的生理指标Tab.2 Physiological indexes of S.nigrum leaves under different treatments

2.3 IAA 和GLDA 对龙葵地上部Cd 和Pb 吸收的影响

由表3 可知：IAA 处理组龙葵地上部Cd 含量与对照相比无显著差异（P＞0.05），而GLDA 处理组和IAA+GLDA 处理组龙葵地上部Cd 含量均显著增加，增幅分别为36.09% 和31.36%（P＜0.05）；龙葵地上部Pb 含量为30.47～38.68 mg/kg，且各处理间差异不显著（P＞0.05）。各处理龙葵地上部Cd 提取量大小顺序IAA+GLDA＞IAA＞GLDA＞CK（图2），其中IAA、GLDA 以及IAA+GLDA 处理组分别较对照显著提高15.05%、14.33%和36.98%（P＜0.05），单 施IAA 和 单施GLDA 龙葵地上部对Cd 的提取量相近，且均显著低于两者联合施用处理组（P＜0.05）；龙葵地上部对Pb 的提取量为296.87～384.09 μg，但各处理间差异不显著（P＞0.05）。

图2 不同处理条件下龙葵地上部 Cd 和Pb 提取量Fig.2 Extraction amount of S.nigrum shoot under different treatments

表3 不同处理条件下龙葵地上部Cd 和Pb 含量Tab.3 Cd and Pb contents in shoot of S.nigrum under different treatments mg/kg

2.4 IAA 和GLDA对土壤有效Cd和Pb含量的影响

由表4 可知：与对照相比，GLDA 处理组和IAA+GLDA 处理组土壤有效态Cd 含量均显著提高，增幅分别为18.97% 和10.34%（P＜0.05），其中GLDA 处理组土壤有效态Cd 含量还显著高于IAA+GLDA 处理组（P＜0.05）；IAA 处理组土壤有效态Cd 含量与对照相比无显著差异（P＞0.05），但显著低于GLDA 处理组和IAA+GLDA 处理组（P＜0.05）。此外，土壤有效态Pb 含量为530.98～574.50 mg/kg，且各处理间差异不显著（P＞0.05）。

表4 不同处理条件下土壤有效态Cd 和Pb 含量Tab.4 Soil available Cd and Pb content under different treatments mg/kg

2.5 土壤有效态Cd 含量与龙葵株高、地上部鲜质量及Cd 含量之间的相关性

由表5 可知：龙葵地上部鲜质量与地上部Cd 含量呈显著负相关、与土壤有效态Cd 含量呈极显著负相关，而龙葵地上部Cd 含量与土壤有效态Cd 含量呈极显著正相关，说明随着土壤有效态Cd 含量的增加或降低，龙葵地上部Cd 含量随之增加或降低，从而导致对龙葵生长的抑制作用增大或减小。

表5 土壤有效态Cd 含量与龙葵株高、地上部鲜质量及Cd 含量之间的相关性Tab.5 Correlation among soil available Cd,plant height,shoot fresh weight and Cd content of S.nigrum

3 讨论

超积累植物生长速度慢、植株矮小、生物量低，是植物修复技术的制约因子[18]。近年来，IAA 由于对植物生长具有促进作用，在土壤重金属污染的植物修复领域得到关注，并主要通过植株株高、鲜质量和干质量等指标直观反映其施用效果。何冰等[19]研究发现：IAA 处理通过提高生物量和缓解Cd 对叶片的毒害，从而增加东南景天地上部对 Cd 的积累；RAN 等[20]的研究结果证实：施用20 mg/L IAA 能显著促进龙葵生长，增加其地上部对Cd 的积累。本试验中，IAA 单独施用时龙葵株高和鲜质量达到最大值，与前人研究一致，这是因为生长素IAA 的主要生理功能是调节细胞分裂[21-22]，改善龙葵的生长状况。而螯合剂GLDA 单独施用时龙葵株高和鲜质量均低于其他处理，是由于施用GLDA 增加了龙葵叶片中的MDA 含量，降低SOD、POD 和CAT 活性，造成细胞膜系统的破坏。其机制可能包括两方面：一是GLDA 增加了土壤中重金属的溶解性，并通过蒸腾作用将其快速运输到龙葵地上部，不利于龙葵生长，这一点可以从添加GLDA 后土壤有效态Cd 含量显著提高、而龙葵地上部鲜质量与土壤有效态Cd 含量呈显著负相关得以证实；另一方面，未与重金属形成螯合物的游离态GLDA 可能具有一定的生物毒性[23-24]，对龙葵生长造成胁迫，其具体作用机制有待进一步研究。

在本研究中，GLDA 和IAA+GLDA 处理下龙葵地上部Cd 含量较对照呈显著增加趋势，可能是因为龙葵地上部Cd 含量与土壤有效态Cd 含量呈极显著正相关，而GLDA 含有能够提供空轨道的配体，如羟基或羧基等，可与Cd 形成稳定的可溶螯合物，从而提高土壤Cd 的有效性[25]。同时，添加植物激素IAA 可以调节植物活性氧代谢和蛋白质的表达，与其受体结合可以调节质膜上的 H+-ATPase 活性，引起质膜离子通道打开或激活细胞质膜离子运动，从而在减轻重金属对植物胁迫的同时又不会抑制GLDA 对土壤Cd 的溶解效应[26-27]，使联合施用处理组龙葵对Cd 的吸收与对照相比仍然显著提升。土壤有效态Cd 含量在GLDA 单施及IAA+GLDA 联用时变化比较明显，较对照分别增加10.34%和18.97%，可能是因为GLDA 与土壤中重金属离子发生反应形成重金属络合物，使土壤液相中离子浓度低于平衡水平；而为维持重金属离子在固—液相间的平衡，大量重金属离子从土壤固相中解离，由无效态转化为有效态，从而提高重金属有效态的含量[28]。在龙葵地上部Cd 和Pb 含量中，Pb 含量较对照变化不大，各处理间差异不显著，这与龙葵是Cd 的超富集植物、而对Pb 的吸收能力有限有关。

植物重金属提取量是衡量植物修复重金属污染土壤效果的关键指标，其值为生物量与植物体重金属含量的乘积。在本研究中，单施IAA 或GLDA 均能显著提高龙葵地上部Cd 提取量，表现出一定的应用价值。然而，从研究结果来看，IAA 处理组土壤有效态Cd 与对照相比并未有明显变化，因此，在重金属有效性本身较低的土壤上单施IAA 存在较大局限。GLDA 处理组土壤有效态Cd 含量虽然较对照显著增加，但却对龙葵的生长产生明显的胁迫，影响总提取量。IAA+GLDA 处理组龙葵对Cd 和Pb 的提取量最大，分别达606.32 和384.09 μg，与对照相比分别提高36.98%和29.38%。其原因是IAA 与GLDA 联用后，两者的协同作用得到发挥，在提高龙葵地上部生物量的同时还促进对重金属的吸收。本研究是在温室盆栽条件下完成，初步发现IAA 与GLDA联用对龙葵修复Cd-Pb 复合污染土壤具有一定的强化效果，其在大田试验中表现如何、条件如何优化、与之相对应的作用机理有哪些？值得下一步深入探讨。

4 结论

在污染土壤中，单独施用GLDA 虽然能提高土壤有效态Cd 含量，促进龙葵地上部对Cd 的吸收，但同时也可增加龙葵叶片丙二醛含量，降低抗氧化酶活性，显著抑制龙葵生长。将IAA 与GLDA 联用能减轻龙葵的毒害作用，并强化龙葵对污染土壤的修复，使其地上部Cd 提取量较对照提高36.98%。因此，IAA 与GLDA 联用在提高超积累植物对重金属的提取效率方面有一定的应用前景。