电针额区对血管性痴呆大鼠认知功能及SIRT1/NF-κB信号通路的影响

马 莉，王佳惠，毛 靖，苏立林，李秀娟，张 良

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学研究生院，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150040）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）可定义为与血管性脑损伤相关的神经退行性疾病，主要表现为认知能力下降和记忆力减退[1]。据报道，随着人口老龄化和脑血管疾病风险的增加，全球痴呆患者的数量将在2030年达到6 600万，在2050年达到1.2亿。VD发病率仅次于阿尔茨海默氏病，约占所有痴呆的15%～20%[2]。目前对VD的发病机制尚未完全阐明，可能与神经生化机制、细胞和分子机制、炎性反应及遗传等机制相关，而炎性反应机制在急性脑缺血后继发性神经损伤中起主要作用[3]。沉默信息调节蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）在海马神经元内表达丰富，是细胞内信号传导网络的关键靶点，SIRT1通过去乙酰化作用抑制核转录因子κB（NF-κB）炎性信号传导，在调控血管性认知功能障碍以及细胞凋亡方面起着重要作用[4]。因而本研究拟通过改良的2-VO法制作VD模型，探讨VD发展过程中认知功能障碍的病理变化和可能的分子生物学机制。

1 材料方法

1.1 实验动物

选用纯系Wistar健康雄性大鼠60只，体质量为（250±30）g，均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 主要实验试剂与仪器

TGL—16G 冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；生物显微镜（日本OLYMPUS公司）；电动玻璃匀浆机（宁波新芝科学仪器研究所）；一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司；规 格：0.20 mm×13 mm）；KWD—808I脉 冲电疗仪（常州市武进长城医疗器械有限公司）；Morris水迷宫系统。抗SIRT1抗体、抗NF-κB p65抗体、抗β-actin抗体；BCA蛋白定量试剂盒；ECL化学发光试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 模型制备及分组

60只Wistar大鼠随机分为4组，每组各15只，分别为：假手术组、模型组、西药组和电针组。实验动物在实验室进行1周适应性训练后，应用改良2-VO阻断法进行造模。各组大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛，按照0.35 mL·100 g-1的计量进行麻醉，仰卧位固定头部和四肢，颈部备皮消毒铺巾，在颈部正中行切口，充分暴露两侧颈总动脉，动脉夹阻断血流20 min后恢复血流10 min，接着再次阻断血流 20 min，如此重复操作3次[11]。第3次血流恢复后用生理盐水浸润过的4号丝线结扎两侧颈总动脉，观察生命体征状态平稳后缝合伤口、常规消毒。假手术组暴露颈总动脉后仅进行迷走神经钝性剥离，各组大鼠肌肉注射20万单位青霉素以预防伤口感染。手术造模成功后，待各组大鼠伤口愈合后同时进入治疗阶段。

1.4 干预方法

电针组选穴按照于致顺老师头针疗法，选取神庭至囟会及其左右各1寸、2寸的平行线处丛刺，针刺方向为向后方斜刺，大鼠取穴参照《实验动物针灸穴位图谱》及《实验针灸学》。针刺后选取左右最外侧两针连接脉冲电疗仪，波形选用疏密波、频率2 Hz、时间20 min，电针强度以针身或者大鼠耳部轻微颤抖为度，电针结束后继续留针10 min，每日1次。西药组、模型组与假手术组予以相同条件下抓取，并在特制的鼠板上停留，抓取捆绑次数同电针组。西药组用实验浓度为40 mg·mL-1的脑复康水溶液，剂量按照10 mL·kg-1进行灌胃，每日1次。模型组与假手术组均用生理盐水灌胃，给药体积及频次同西药组，每日1次，连续给药30 d。

1.5 检测指标

1.5.1 Morris水迷宫检测 使用Morris水迷宫评估各组大鼠空间学习和记忆能力。测试前进行适应性训练4 d，避免大鼠在进行实验时产生应激性刺激。

第一阶段为定位航行实验，连续5 d，每天训练4次，每只大鼠每次放入水中的次序和位置保持一致。记录大鼠在120 s内成功发现隐藏站台需要的时间，保证平台停留时间超过10 s且没有再次跌落水中后停止计时，4次寻找到平台的平均成绩即为该大鼠的逃避潜伏期。若在120 s规定时间内大鼠还未发现站台则人为地将其引导爬上站台后停留15 s，并记录此次逃避潜伏期为120 s。第二阶段为空间探索实验，在第6 d撤掉隐藏的站台，将各组大鼠在同一位置依次放入水迷宫中，记录各组大鼠在120 s内跨越原平台位置次数。

1.5.2 Western blot法检测 大脑海马区SIRT1，NF-κB p65的蛋白表达水平，预冷生理盐水冲洗海马组织，将组织剪碎充分研磨，加入配置好的裂解液，离心后吸取上清液，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。使用TBST缓冲液漂洗PVDF膜，随后放入一抗稀释液中，置于4 ℃冰箱反应过夜。TBST洗膜15 min，重复3次，随后孵育二抗，再次洗膜后ECL显影，扫描后存档。应用Image—Pro Plus软件进行蛋白灰度分析，将目的蛋白与内参β-actin条带的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0版软件对各组数据进行统计学分析，所有实验数据以均数±标准差（±s）来表示。多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异提示有统计学意义。

2 实验结果

2.1 Morris水迷宫检测结果

定位航行实验中，模型组的逃避时间明显增长，差异具有显著性（P＜0.05）。在空间探索实验中，模型组的象限跨越次数明显少于假手术组（P＜0.05），表明大鼠学习记忆能力下降，该模型成立。与模型组相比电针组、西药组的逃避潜伏时间明显缩短（P＜0.05），跨越原平台次数明显增加（P＜0.05），电针组与西药组相比无统计学意义（P＞0.05），说明西药组和电针组都能持续有效地改善VD大鼠的学习记忆能力。结果见表1。

表1 各组大鼠的逃避潜伏期和穿越平台次数比较（±s，n= 15）

表1 各组大鼠的逃避潜伏期和穿越平台次数比较（±s，n= 15）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05

组别逃避潜伏期/s 穿台次数/次第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手术组 48.23±2.59 43.41±3.72 36.67±4.17 26.58±4.18 23.83±4.14 9.13±1.30模型组 77.71±3.44# 64.48±8.35# 56.46±3.84# 45.80±4.92# 41.38±5.16# 2.66±1.23#西药组 51.71±1.91#△ 49.38±4.52#△ 41.01±2.82#△ 36.91±3.62#△ 32.81±3.93#△ 6.60±1.35#△电针组 51.81±3.44#△▲ 48.23±4.82#△▲ 39.51±2.35#△▲ 35.50±4.53#△▲ 31.90±3.72#△▲ 7.20±1.14#△▲

2.2 各组大鼠海马区SIRT1/NF-κB通路相关蛋白水平的表达

与假手术组相比，模型组SIRT1蛋白表达降低（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表达明显升高（P＜0.05），表明模型组大鼠海马区形成了组织损伤，实验模型具有有效性。与模型组相比，电针组和西药组SIRT1表达升高（P＜0.05），NF-κB p65表达明显降低（P＜0.05），电针组与西药组相比无统计学意义（P＜0.05），结果提示电针额区可调整VD大鼠海马区SIRT1/NF-κB信号通路的传导。各组大鼠海马区SIRT1、NF-κB p65蛋白表达比较以及电泳图见图1。

图1 各组大鼠海马区SIRT1、NF-κB p65蛋白表达比较以及电泳图

3 讨论

血管性痴呆常发生在中风等一系列脑血管疾病之后，主要临床表现为记忆力减退、善忘、反应迟钝、肢体无力、智能低下等[5]。VD是现代医学的命名，在中医学中被划分为“文痴”“呆病”以及“中风”等范畴。《针灸大成》中记载“心性痴呆，悲泣不已”，《灵枢·海论》中提及“脑为髓之海，髓海不足，则脑转耳鸣……懈怠安卧”。VD基本病机为本虚标实，以肾精亏虚为本，痰浊阻络为标。随着年龄增长，素体正虚、髓海渐空，体内气血津液功能失调、互生瘀结日久损伤脑络，致使脑髓失养、神明不行而致呆病[6]。头针疗法是在传统针灸学及人体解剖学、神经生物等学科的基础上发展形成的，头部是十四经穴、奇穴以及新穴分布最集中的区域，诸多头穴皆与髓海相通，可运行经气、濡养髓海，发挥调节人体气血阴阳的作用[7]。

额区丛刺法源于我校于致顺教授头针疗法，其“针场”假说结合了现代大脑皮层定位理论与传统中医的经络学说，通过刺激局部大脑皮层及有关部位，调动和激发机体自我调节机制，改善脑部循环及神经功能，对相应部位的病理状态进行动态调整[8]。于老将头部划分为7个区，其中额区在解剖学中为额叶前部，具有进行记忆、思维、情绪、分析以及感觉信息加工等功能，从神经定位的层面看，额叶前部是额叶联合区，主要负责精神情感活动[9]。神庭、囟会在七区划分中属额区，神庭为督脉、足太阳经及阳明经之会，其位于脑海前庭，为神志所在，主要有宁神、开窍、疏郁之功[10]。《针灸穴名解》[11]中解释：“人当思虑之际，神识会于囟门”，又如《针灸甲乙经》所言：“囟会……督脉气所发”，可见针刺神庭、囟会穴可激发督阳、调养元神。丛刺是以督脉为基线，在纵向维度的基础上、亦从横向出发，对头部的刺激由原来的单一的点刺或是线刺扩展到面状刺激[12]。然而电针相较于普通针刺，其刺激量更大，因此更能激发丛刺产生的“场”，进一步调节脑功能。因此，额区丛刺联合电针可用于治疗智能及精神神志类疾病，包括记忆力减退、癫、狂、痫等神志变化症状[13]。笔者通过治疗血管性痴呆的临床经验以及前期成果发现[14]，该方法不仅能够促进脑部神经元恢复，对血管性痴呆患者的临床症状也有较好的改善。

VD的发病与脑组织慢性低灌注及代偿性灌注增多引起的缺血再灌注损伤密切相关[15]，而大脑海马区神经元对脑缺血反应最为敏感，是学习和记忆能力形成的重要部位[16]。因此本实验中采用改良的2-VO法制作VD动物模型，此方法特点为先形成急性缺血再灌注，最后造成慢性低灌注状态，与VD形成机制最为接近，容易对海马、大脑皮层的神经元造成损伤[17]。本实验应用Morris水迷宫实验研究和评估动物认知能力[18]，结果提示电针组的各项实验成绩明显优于模型组，表明电针额区能够显著提高VD大鼠空间位置感和方向感的学习水平。越来越多的资料表明，炎性机制在VD的发病机制中的地位日益受到重视，脑组织缺血缺氧发生后，胶质细胞活化增多，促使细胞内钙超载、炎性因子及氧自由基释放[19]。局部神经元、内皮细胞被激活后，通过释放白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子从而触发炎性反应，导致其他细胞因子及炎性代谢产物共同促使白细胞迁移至炎症组织的损伤区域，导致血管再闭塞。白细胞还可以产生蛋白水解酶和其他效应分子, 引起神经元的直接损伤[20]。SIRT1是一种蛋白去乙酰化酶，具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性，其功能多样化且复杂，主要可通过转录因子调节蛋白质表达使转录因子脱乙酰化，以及细胞应激反应、神经保护、细胞衰老凋亡等生物学效应，并且SIRT1在海马神经元内表达丰富。NF-κB是几乎存在于所有动物的细胞中的一种蛋白质复合物，能够控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活，多数以异源二聚体 p65的形式存在，广泛参与细胞对各种刺激的应答[21]。NF-κB也是脑缺血损伤后反应最早的关键炎症因子，通过增强TNF-α、I L-1β等促炎性因子基因的表达，间接促进炎性反应[22]。SIRT1发生去乙酰化反应后促使其下游因子NF-κB p65和p53去乙酰化，进而抑制其转录活性，同时抑制IκBα磷酸化，被激活的NF-κB p65可促进促炎因子的合成和释放，而这些被激活的促炎因子又反过来活化NF-κB，造成持续性的炎性反应[23]。

SIRT1/NF-κB信号通路可参与VD病理机制中炎性因子的产生，当对SIRT1进行活性诱导时，可通过抑制NF-κB信号活化，防止炎症引起的神经元损伤，降低细胞凋亡的发生。大量的研究资料证明，SIRT1/NF-κB信号通路能够发挥细胞生长、代谢、应激及炎性反应等多种病理生理过程，如应用电针改善肥胖II型糖尿病大鼠胰岛素抵抗[21]，温针灸疗法有效降低RA大鼠血清炎性因子[24]等诸多论述，逐渐成为各类疾病研究治疗的热点。本研究发现模型组大鼠SIRT1蛋白表达明显减少，NF-κB p65表达明显增多，电针组大鼠SIRT1蛋白表达水平显著升高，NF-κB p65表达降低，促炎因子表达明显减少，表明电针额区可上调SIRT1蛋白的表达，降低磷酸化NF-κB的水平，抑制促炎因子表达，进而发挥神经保护作用。