银杏叶荷叶总黄酮的提取及保健饮料的研制*

李玲玲

(重庆工贸职业技术学院健康学院，408000，重庆市)

0 引 言

荷叶具有特殊的药理保健功效，被卫生部列为药食两用原料[1].对荷叶有效成分的检测、分离纯化、药理功能等的研究受到广泛关注[2-4].荷叶是传统的降暑祛火饮品[5]，然而目前仅有极少部分的荷叶资源被用于医疗、食品及保健等行业，因此很有必要加强荷叶相关产品的开发.

银杏叶为银杏科银杏属植物银杏的干燥叶，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、调血脂的功效.银杏叶的生物活性成分复杂，其中包含银杏黄酮、银杏内酯、银杏酸和聚异戊烯醇等[6].黄酮类化合物可以清除体内的自由基，调节肠胃，有延缓衰老、养生保健的效果[7].

目前已有将中药材加入饮料增加功能性的研究报道[8,9].荷叶和银杏叶同时饮用时有清热去火、通络止痛、敛肺平喘、调血脂等作用.因此本研究拟采用银杏叶和荷叶为原料制备复合饮料，为黄酮类保健饮料的开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

银杏叶、荷叶：重庆衡生中药制药有限公司；白砂糖、柠檬酸为食品级，市售；硝酸铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院.

1.2 仪器与设备

HH-2型电热恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；SF320型粉碎机(浙江永康市素锋工贸有限公司)；ZA220R4型分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；T6紫外分光光度计(屹谱仪器制造(上海)有限公司)；SHB-DIII型循环水式真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)；LDZX-75KBS型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；SHP-250型生化培养箱(上海三发科学实验有限公司)

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[10]的方法绘制芦丁标准曲线.

芦丁对照品溶液的制备：称取0.0052 g芦丁标准品，加少量甲醇溶解，并用甲醇定容至25 mL，摇匀后静置，配成对照品溶液(芦丁浓度 0.208 mg/mL).

取对照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL分别于25 mL比色管中，加蒸馏水6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min；然后加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，放置6 min；最后加1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，用甲醇定容至25 mL，混匀，放置15 min.在波长506 nm处测定吸光度值.以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线图，得出回归方程.

1.3.2 银杏叶、荷叶总黄酮最佳浸提工艺的确定

将干燥的银杏叶和荷叶用粉碎机粉碎，分别过80目筛，收集细粉.银杏叶和荷叶细粉分别与蒸馏水按照1∶20混合，放入水浴锅中恒温浸提一段时间后，真空抽滤泵抽滤，滤液作为银杏叶浸提液和荷叶浸提液.

分别将1 mL银杏叶浸提液和荷叶浸提液置于25 mL比色管中，按照1.3.1的方法测定银杏叶和荷叶浸提液的吸光度，根据回归方程计算出总黄酮含量C，代入下面的公式计算银杏叶浸提液和荷叶浸提液总黄酮含量R

(1)

式中，C为由回归方程计算出的总黄酮浓度；V1为比色管的体积(25 mL)，mL；V2为测定吸光度时吸取的浸提液体积(1 mL)，mL,R的单位是mg/mL.

进一步计算银杏叶粉和荷叶粉总黄酮的提取率η

(2)

式中，R为银杏叶浸提液或荷叶浸提液的总黄酮含量，单位mg/mL；V3为浸提后银杏叶或荷叶滤液的总体积，单位mL；m为银杏叶粉或荷叶粉的质量，单位g.

根据总黄酮提取率确定银杏叶和荷叶的最佳浸提工艺.

1.3.3 调配

将白砂糖、柠檬酸加热溶解，与荷叶浸提液、银杏浸提液按照一定比例混合均匀，用蒸馏水定容至100 mL.

将配制好的饮料置于灭菌锅内90 ℃杀菌25 min，即为成品.

1.4 单因素试验

1.4.1 银杏叶浸提液添加量的确定

固定添加荷叶浸提液20%(体积百分比浓度、下同)、白砂糖8%(质量百分比浓度、下同)、柠檬酸0.15%(质量百分比浓度、下同)，分别添加体积百分比浓度为5%,10%,15%,20%,25%的银杏叶浸提液，混合、定容至100 mL，进行感官评定.

1.4.2 荷叶浸提液添加量的确定

固定添加银杏叶浸提液20%,白砂糖8%,柠檬酸0.15%，分别添加5%,10%,15%,20%,25%的荷叶浸提液，混合、定容至100 mL，进行感官评定.

1.4.3 白砂糖添加量的确定

固定添加荷叶浸提液20%,银杏叶浸提液10%,柠檬酸0.15%，分别添加5%,6%,7%,8%,9%,10%的白砂糖，混合、定容至100 mL，进行感官评定.

1.4.4 柠檬酸添加量的确定

固定添加荷叶浸提液20%,银杏叶浸提液10%,白砂糖9%，分别添加0.05%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%的柠檬酸，混合、定容至100 mL，进行感官评定.

使用保水剂并于浇水后每隔10天测定一次结果，浇水后第一次测定的结果进行分析，施用保水剂后相比对照土壤的含水量有明显增加。经过3次土壤含水量的测定，保水剂显示出对土壤水分的保持作用，但3种保水剂保水效果存在明显差异。旱地宝农林专用保水剂和农林用长效型保水剂均在测定中后期表现出了良好的保水能力，延长了土壤有效水的供应时间，且旱地宝蓄水能力更强。R101型保水剂在测定中期表现出良好的保水能力，但后期差别逐渐减小，说明保水剂保存的水分可能已部分供应作物吸收利用。综上所述，保水剂对土壤含水量的影响为：旱地宝农林专用保水剂＞农林用长效型保水剂＞R101型保水剂。

1.5 正交实验

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化保健饮料的配方.正交试验因素与水平见表1.

表1 正交试验因素水平

1.6 感官评价

为了评价保健饮料的感官质量，制定了感官评分表[11]，见表2.

表2 银杏叶荷叶保健饮料感官评分标准

续表2 银杏叶荷叶保健饮料感官评分标准

1.7 微生物指标检测

微生物指标(大肠菌群[12]、菌落总数[13]、霉菌和酵母[14])按照国标GB7101-2015[15]进行检测.

1.8 保健饮料总黄酮含量测定

取1mL制备好的保健饮料，按照1.3.1的方法测定吸光度值，由回归方程计算出比色管中饮料的总黄酮含量，代入1.3.2的公式(1)计算出保健饮料的总黄酮含量.

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度为横坐标，相应浓度的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线，见图1，同时得回归方程y=10.915x-0.0046，相关系数R2=0.9995.

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 银杏叶最佳浸提工艺的确定

固定料液比1∶20，在80 ℃,90 ℃条件下分别浸提30 min,40 min,50 min,60 min，测定银杏叶总黄酮含量，结果见表3.

表3 不同浸提温度和时间对银杏叶总黄酮含量的影响

由表3可知，80 ℃浸提50 min时银杏叶浸提液中总黄酮含量最高,此时，银杏叶粉总黄酮提取率为8.78 mg/g.

2.2.2 荷叶最佳浸提工艺的确定

固定料液比1∶20，在80 ℃和90 ℃恒温条件下分别浸提不同时间，测定荷叶总黄酮含量，结果见表4.

表4 不同浸提温度和时间对荷叶总黄酮含量的影响

由表4可知，90 ℃浸提50 min时荷叶浸提液总黄酮含量最高,此时荷叶粉总黄酮提取率为53.50 mg/g.

2.2.3 荷叶浸提液对复合饮料感官的影响

荷叶浸提液会影响复合饮料的颜色和口感.荷叶浸提液添加量低于15%时，保健饮料的银杏叶口感较重，荷叶味道不突出；添加量大于20%后，荷叶口感过浓；因此荷叶浸提液最佳添加量为20%，此时保健饮料的气味协调.

2.2.4 银杏叶浸提液对复合饮料感官的影响

研究过程中发现，银杏叶浸提液添加量为5%时，保健饮料中银杏叶口感淡，荷叶味较重；添加量大于10%后，保健饮料中银杏的口感逐渐增强；含量继续增加，苦涩感加重.因此银杏叶浸提液最佳添加量为10%.

2.2.5 白砂糖添加量的确定

白砂糖会影响保健饮料的甜度.白砂糖含量低于7%时，保健饮料过酸；含量达到8%时，口感微酸；白砂糖含量达到10%时，甜度过大.因此白砂糖最佳添加量为9%.

2.2.6 柠檬酸添加量的确定

柠檬酸会影响保健饮料的酸甜度.柠檬酸添加量低于0.10%时，保健饮料过甜；柠檬酸添加量大于0.20%时，保健饮料又过酸. 因此最佳的柠檬酸添加量为0.15%.

2.3 正交试验结果

保健饮料配方优化正交试验结果见表5.

由表5中的R值可以看出，影响保健饮料感官质量最大的因素是荷叶浸提液，其次是柠檬酸，然后是银杏叶浸提液和白砂糖；结合K值大小得出最佳组合为A3B3C3D2，此组合不在表5中，为考察最佳条件，需进行验证试验.

对最佳组合A3B3C3D2进行验证，最终感官评价总分96分，此时保健饮料口感最好，颜色为淡黄色，澄清透明，口感不涩，酸甜适中，有银杏叶和荷叶特有的清香.

表5 正交试验结果与分析

2.4 微生物指标检测结果

微生物指标：银杏叶荷叶保健饮料的菌落总数、霉菌和酵母菌、大肠菌群均未检测出，微生物指标符合国标GB7101-2015中关于饮料微生物限度的规定.

2.5 总黄酮含量测定结果

经测定，保健饮料的吸光度值为0.2933，由2.1的回归方程y=10.915x-0.0046可以计算出保健饮料的总黄酮含量为0.027 mg/mL，将此浓度代入公式(1)中，计算出保健饮料最终总黄酮含量为0.68 mg/mL.

3 结 论

银杏叶总黄酮最佳浸提工艺为：料液比1∶20，80 ℃浸提50 min，此条件下银杏叶总黄酮提取率为8.78 mg/g；荷叶总黄酮最佳浸提工艺为：90 ℃浸提50 min，此条件下荷叶总黄酮提取率为53.50 mg/g.银杏叶荷叶保健饮料的最优配方为：银杏叶浸提液15%(体积百分比浓度)，荷叶浸提液20%(体积百分比浓度)，白砂糖10%(质量百分比浓度)，柠檬酸0.15%(质量百分比浓度).此条件下，银杏叶荷叶保健饮料呈淡黄色，色泽均匀，酸甜适中，总黄酮含量为0.68 mg/mL.