白细胞介素-33对心力衰竭小鼠趋化因子2/趋化因子2受体介导的调节性T细胞表达及心肌纤维化的影响△

李金贤，莫 煊，程新春，谢 荣

［1.新疆维吾尔自治区人民医院康复医学科，乌鲁木齐 830000；2.广州医科大学附属第五医院心理（精神）科，广州 510700；3.新疆维吾尔自治区人民医院老年医学科，乌鲁木齐 830000］

心力衰竭为多种心血管疾病的终末期阶段，具有较高发病率和病死率［1-2］。心力衰竭可由多种原因引起，发病机制比较复杂，研究发现，心肌组织炎症反应、免疫应激、纤维化等导致的心室重构在心力衰竭过程中起到重要作用［3-4］。趋化因子2（chemokine 2，CCL2）又称为单核细胞趋化因子，可识别趋化因子2 受体（CCL2 receptor，CCR2），刺激单核/巨噬细胞、活性T 细胞等炎性细胞，增强机体炎症反应［5-7］。大量研究发现，炎症反应与机体纤维化呈正相关，随着小鼠肺纤维化的发展，小鼠肺组织中炎症反应也增强［8］。白细胞介素（interleukin，IL）-33 为细胞因子IL-1 家族的新成员，是一种生物力学诱导蛋白，主要由心脏成纤维细胞合成［9］。研究发现，IL-33 可阻断心肌纤维化，保护心脏组织，减轻心力衰竭［10-11］。然而CCL2/CCR2 通路在IL-33 治疗心力衰竭过程中是否发挥作用，仍需进一步研究。本研究通过构建小鼠心力衰竭模型，采用重组IL-33 和IL-33 抑制剂处理，探究IL-33 对心力衰竭小鼠的影响以及对CCL2/CCR2 通路的影响，为心力衰竭临床治疗提供新的思路。

1 材料及方法

1.1 动 物

BALB/c 小鼠，雌雄兼有，体质量18～20 g，购自北京北生研生物制品有限公司，许可证号：SYXK（京）2016-0051。适应性饲养一周，自由采食饮水。

1.2 主要试剂

苏木素伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（货号：G1120）、Masson 染色试剂盒（货号：G1340）、小鼠鼠重组IL-33（货号：P00159）均购自北京索莱宝科技有限公司。IL-33 抗体（货号：ab207737）购自英国Abcam 公司。CD4 抗体（货号F1773），CD25 抗体（货号：FCMAB189F）购自美国Sigma-Aldrich 公司。CCL2（货号：14-7096-81）、CCR2（货号：PA5-23037）一抗及二抗（货号：31460），均购自美国Thermo Fisher公司。GADPH一抗（51332）购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 实验仪器

光学显微镜购自日本Olympus 公司，动物彩色多普勒超声检测仪购自上海麦本医疗科技有限公司，流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司，蛋白电泳仪购自北京凯元信瑞仪器有限公司，凝胶成像系统购自美国ProteinSimple 公司。

1.4 实验方法

1.4.1 心力衰竭小鼠动物模型制备 参考参考文献［12］，采用冠状动脉结扎法建立小鼠心力衰竭模型。用1.0%戊巴比妥钠按1 mL/kg 剂量腹腔注射，将小鼠麻醉，常规消毒，连接心电图，气管插管，连接至小动物呼吸机，辅助通气。经左侧剪开皮肤，于3～4 肋间钝性分离肌肉组织，露出心脏，在左冠状动脉前降支1～2 mm处结扎。当心电图显示ST 段持续升高，左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜45%，表明造模成功。然后迅速将小鼠心脏放回胸腔，消毒缝合。假手术组只打开胸腔，露出心脏，不结扎冠状动脉。

1.4.2 动物分组 按照随机分组，将小鼠分成假手术组、模型组、IL-33 组和IL-33 抑制剂组，每组12 只。造模前1 h，IL-33 组尾静脉注射400 μg/mL重组IL-33 5 μL，IL-33 抑制剂组注射400 μg/mL IL-33 抑制剂12.5 μL，假手术组和模型组注入5μL 磷酸盐缓冲液。

1.4.3 各组小鼠心功能指标检测及样本采集 造模24 h 后，将小鼠麻醉，仰卧固定于手术台，采用多普勒超声心电图进行超声观察，并计算小鼠心脏收缩末期左心室内径（left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs），舒张末期左心室内径（left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricu⁃lar fractional shortening，LVFS）变化。

检测完成后，各组小鼠摘眼球取血，肝素抗凝，用于后续流式细胞检测。每组小鼠随机选取6 只，取心脏组织置于甲醛中固定，取另外6 只小鼠心脏于液氮中速冻，置于-80℃中保存。

1.4.4 流式细胞检测免疫功能指标 取1.4.3 制备的抗凝血，加入表面标记抗体CD4 和CD25 混合液，避光孵育加溶血素，900 rmp/min 离心10 min，弃上清，加磷酸盐缓冲液清洗，并将细胞数调整为1×106个细胞/mL，使用流式细胞仪检测。其中CD4+CD25+标记的为调节性T 细胞（T regulatory cell，Treg cell）。

1.4.5 苏木素伊红染色观察各组小鼠心脏组织形态学变化 取出甲醛固定的心脏组织，脱水、透明，石蜡包埋，切片，使用HE 染色，在光学显微镜下观察各组小鼠的心脏组织病理变化。

1.4.6 Masson 染色观察并检测胶原容积分数 取病理组织切片，根据Masson 染色试剂盒进行染色，在光学显微镜下观察，并计算胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。Masson 染色后，心肌组织为紫红色，胶原纤维被染为蓝色，CVF=胶原纤维面积/切片面积×100%。

1.4.7 Western blot 法检测小鼠心脏组织蛋白水平变化 取-80℃中保存的心脏组织，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂，液氮研磨，提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，取20 mg 蛋白上样十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，分离总蛋白，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下使用5%脱脂奶粉封闭1 h，然后与CCL2、CCR2、GAPDH 一抗孵育，在4℃下过夜，然后洗膜，将膜与二抗在室温下孵育1 h。曝光显色，使用凝胶成像系统分析蛋白质的相对表达量，以GAPDH 为内参蛋白。

1.5 统计学分析

本研究所得数据均采用SPSS 22.0 软件进行统计，计量资料以（）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白细胞介素-33 对小鼠心功能指标的影响

与假手术组相比，模型组小鼠LVIDs 和LVIDd显著升高（P＜0.05），LVEF 和LVFS 显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，IL-33组LVIDs和LVIDd显著降低（P＜0.05），LVEF 和LVFS 显著升高（P＜0.05），IL-33 抑制剂组LVIDs 和LVIDd 显著升高（P＜0.05），LVEF 和LVFS 显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠心功能指标比较 ［］

表1 各组小鼠心功能指标比较 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

2.2 白细胞介素-33 对小鼠外周血中调节性T 细胞百分比的影响

与假手术组相比，模型组CD4+CD25+Treg 细胞百分比显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，IL-33组CD4+CD25+Treg 细胞百分比显著升高（P＜0.05），IL-33 抑制剂组CD4+CD25+Treg 细胞百分比显著降低（P＜0.05），见图1、表2。

图1 流式细胞术检测结果

表2 各组小鼠外周血中Treg 细胞水平比较 ［］

表2 各组小鼠外周血中Treg 细胞水平比较 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

2.3 白细胞介素-33 对小鼠心脏组织病理变化的影响

HE 染色结果显示，假手术组心脏组织正常，心肌细胞排列整齐，肌纤维完整，无炎性细胞浸润。模型组小鼠心肌细胞肥大变性，排列不规则，心肌纤维断裂，间隙增大，出现坏死及纤维化，有大量炎性细胞浸润。与模型组相比，IL-33 组小鼠心脏组织病变程度减轻，炎性浸润程度降低；IL-33 抑制剂组小鼠心脏组织病变程度更加严重，炎性细胞浸润程度升高，见图2。

图2 各组小鼠心肌组织HE 染色结果（×200）（A：假手术组；B：模型组；C：IL-33 组；D：IL-33 抑制剂组）

2.4 白细胞介素-33 对小鼠心脏组织纤维化及胶原容积分数的影响

Masson 染色结果显示，假手术组心肌组织正常，几乎无纤维化。模型组小鼠心肌纤维断裂，可见大量胶原纤维沉积。与模型组相比，IL-33 组小鼠心肌组织中胶原纤维沉积减少；IL-33 抑制剂组小鼠心肌组织胶原纤维沉积增加，见图3。

图3 各组小鼠心肌组织Masson 染色结果（×200）（A：假手术组；B：模型组；C：IL-33 组；D：IL-33 抑制剂组）

与假手术相比，模型组小鼠心肌组织CVF 显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，IL-33 抑制剂组小鼠心肌组织CVF 显著升高（P＜0.05），IL-33 组小鼠心肌组织CVF 显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠心脏组织CVF 比较 ［］

表3 各组小鼠心脏组织CVF 比较 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

2.5 白细胞介素-33 对小鼠心脏组织CCL2、CCR2蛋白水平的影响

与假手术组相比，模型组小鼠CCL2 和CCR2蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，IL-33 组CCL2 和CCR2 蛋白水平显著降低（P＜0.05），IL-33 抑制剂组CCL2 和CCR2 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 小鼠心脏组织蛋白western blot 检测结果（A：假手术组；B：模型组；C：IL-33 组；D：IL-33 抑制剂组）

3 讨论

心力衰竭是心脏结构、功能、节律或传导异常的结果，主要是由心肌梗死（收缩功能障碍）、原发性高血压（高血压）（舒张功能障碍和收缩功能障碍）引起，或者两者兼而有之［13］。心室重构会引起心排血量不足、心肌舒张和收缩功能障碍、血液循环系统产生淤血等具体临床特征，心肌代谢、心脏收缩舒张功能、心脏负荷、耗氧量、血管扩张等指标对分析心功能损伤的程度具有关键作用［1］。心肌细胞肥大和心肌纤维化是心力衰竭常见的病理生理过程，研究发现，抑制心肌纤维化能有效改善心力衰竭小鼠心功能［14］。本研究采用冠状动脉结扎法建立小鼠心力衰竭模型，结果显示小鼠心肌细胞肥大变性，排列不规则，心肌纤维断裂，间隙增大，出现坏死及纤维化，有大量炎性细胞浸润，LVIDs、LVIDd 和CVF 升高，LVEF、LVFS 降低，表明心力衰竭小鼠心肌组织纤维化，造成心脏功能障碍，说明模型建立成功。Treg 细胞可分泌IL-10等抗炎性细胞因子，抑制对自身和非自身抗原的异常或过度免疫反应［15］。有研究发现，参附注射液可改善慢性心力衰竭患者心功能，可能与提高Treg 细胞比例有关［16］。本研究发现，心力衰竭小鼠外周血中Treg 细胞百分比显著降低，表明心力衰竭小鼠免疫失衡，可能与心功能受损有关。

纤维化是长期存在的心肌负荷过重的标志，心肌纤维化与心肌细胞病理生理之间的关系尚不完全清楚。IL-33/ST2 信号通路在自身免疫性疾病过程中，对心肌细胞肥大、心肌纤维化具有抑制作用［17］。本研究中分别注射重组IL-33 和IL-33抑制剂，结果显示，与模型组相比，IL-33 组小鼠心肌组织病变程度减轻，胶原纤维沉积减少，LVIDs、LVIDd 和CVF 显著降低，LVEF、LVFS 和Treg 细胞百分比显著升高；IL-33 抑制剂组小鼠心肌组织病变程度更加严重，纤维化及坏死面积增大，LVIDs、LVIDd 和CVF 显著升高，LVEF、LVFS 和Treg 细胞百分比显著降低，表明IL-33 可减轻心肌组织纤维化及其他损伤，改善心功能，可能与提高Treg 细胞百分比有关。

CCL2 是一种具有广泛生物学活性的低分子蛋白质，CCR2 是CCL2 的主要受体，CCL2 与CCR2相互作用［18］。在肝纤维化中，CCR2 缺失，可明显减轻CCL4 诱导的纤维化程度，说明CCR2 可参与肝纤维进程［19］。Bajpai 等［20］研究发现，心肌损伤后，CCR2/CCL2 表达量显著升高。本研究结果显示，模型组小鼠心脏组织中CCL2、CCR2 蛋白水平显著升高，表明心力衰竭小鼠心脏组织CCL2、CCR2 处于活化状态，可能与心肌纤维化及心功能受损有关。在肝硬化/肝纤维化中，IL-33 可诱导肝细胞产生微蛋白，降低CCR2/CCL2 表达，防治肝损伤和纤维化［21］。本研究中，心力衰竭小鼠经IL-33和IL-33 抑制剂处理后，IL-33 组小鼠心脏组织CCL2 和CCR2 蛋白水平显著降低，IL-33 抑制剂组CCL2 和CCR2 蛋白水平显著升高，表明IL-33 刺激可抑制心力衰竭小鼠心脏组织中CCL2/CCR2 通路活化，减轻纤维化程度。

综上所述，IL-33 可能通过抑制CCL2/CCR2 通路，减轻心力衰竭小鼠心肌组织纤维化，保护心功能，为研究心力衰竭作用机制提供了新思路，但目前IL-33 在心力衰竭过程中的作用尚不十分明确，具体作用机制仍有待于进一步研究。