超声辅助分子印迹固相萃取-HPLC-荧光法测定猪血丸子中苯并（a）芘

◎ 王亮亮，邱 宇，向 俊，荆辉华，王 凯，言 剑，黄 斌

(1.湖南省产商品质量检验研究院，湖南 长沙 410000；2.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410000）

猪血丸子也称“宝庆猪血丸子”“血粑”“豆腐丸子”等，在湘菜标准中称之为“黑珍珠”[1-2]。是湖南邵阳有名的小吃，是邵阳的传统特色食物之一，它有着长达千年的文化历史，蕴含了别具一格的工艺传统。猪血丸子主要以豆腐为主，配上猪血、猪肉以及其他辅料，经熏烧烤制成，风味独特，深受人们喜爱。其制作工艺为：大豆→清洗→浸泡→磨浆→滤浆→煮浆→点浆→养脑→破脑浇制→压榨成型→研磨揉散→加入切碎的猪血、猪肉→搅拌→成型（呈椭圆，厚度约10 cm）→熏烤→高压杀菌→真空包装→质检→成品[1]。猪血丸子一般采用熏烤工艺，熏烤时间越长，风味越浓厚，但是在熏烤过程中容易产生苯并（a）芘等有害物质。

苯并（a）芘（Benzo(a)pyrene，BaP），分子式为C20H12，属多环芳烃，是一种强致癌物质和高活性的突变源，其毒性强于黄曲霉毒素，长期接触可能会导致细胞癌变和DNA受损[3]。目前BaP的主要提取净化方法为有机溶剂分散液-液微萃取（Dispersive Liquid-Liquid Microextraction，DLLME）、有机/无机复合材料固相微萃（Solid-Phase Microextraction，SPME）、中性氧化铝柱萃取（Neutral alumina column extraction，NACE），检测方法主要有液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）、液相色谱-荧光法（Liquid Chromatography Fluorescence Method，LC-RF）及气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS/MS）。但现行有效的国家标准GB 5009.27—2016检测范围并不包括猪血丸子，且因为猪血丸子的分类不清晰，在GB 2762—2017中无明确的BaP限量要求，造成猪血丸子的监管漏洞，无法达到食品安全监管的目的，存在食品安全隐患。考虑到分子印迹技术是利用分子印迹聚合物，通过模拟酶-抗体-抗原的相互作用，对印迹分子有专一识别的特点[4]，特异性强，操作简单，因此试验通过优化猪血丸子中BaP的前处理及分子印迹固相萃取（Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，MISPE）净化方法，开展对猪血丸子中BaP的LC-RF定性定量分析研究，寻求一种快速、准确、简便的检测方法，为猪血丸子的品质控制及安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：BaP（10 mg，纯度：99.0%，CAS：50-32-8，编号：G147406），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH Germany；色谱柱Thermo Scientific Hypersil Green PAH，赛默飞；中性氧化铝柱，迪马科技；分子印迹固相萃取柱Cleanert Bap-3 500 mg/6 mL cartridge，博纳艾杰尔（Agela Technologies）科技；乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、正己烷（色谱纯），上海安谱实验科技；试验用水为超纯水。

猪血丸子样品，均为市售。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪，配RF-M20荧光检测器，日本岛津公司；BK-900C数控超声波清洗器，济宁丰鑫超声设备有限公司；TG16-WS 高速离心机，长沙市湘仪仪器有限公司；TTL-10A实验室专用超纯水系统，北京国泰联科技发展有限公司；MV-5全自动多样品快速浓缩仪，莱伯泰科；电子天平，赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液和标准工作液的配制

准确称取（精确至0.000 1 g）苯并（a）芘标准物质1.02 mg，用甲苯溶解定容至10.0 mL，得标准储备液102 μg·mL-1。准确移取储备液0.1 mL，用乙腈溶解定容至10.0 mL，得1.02 μg·mL-1中间液（现配现用）。再准确移取1.02 μg·mL-1中间液1.0 mL，用乙腈稀释定容至10.0 mL，得102 ng·mL-1中间液（现配现用）。最后分别取0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL的102 ng·mL-1中间液用乙腈稀释定容至10.0 mL，得 0.51 ng·mL-1、1.02 ng·mL-1、5.10 ng·mL-1、10.20 ng·mL-1、20.40 ng·mL-1工作液（现配现用）。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Scientific Hypersil Green PAH柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：乙腈∶水=88∶12；流速1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；荧光检测器：激发波长384 nm，发射波长406 nm。

1.3.3 样品前处理方法

（1）BaP的提取。准确称取粉碎好的样品1 g左右于50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，超声提取，离心后，转移上清液，再加入5 mL正己烷重复提取1次，合并上清液，待净化。

（2）BaP的净化。分子印迹固相萃取柱活化：依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化。上样：将合并的上清液用吸管转移至小柱中，并用少量正己烷淋洗离心管，将淋洗液一并转移至小柱中。淋洗：待样液降至柱床时，用5 mL正己烷淋洗柱子。洗脱：用5 mL二氯甲烷洗脱并收集净化液于10.0 mL塑料离心管中。浓缩：将净化液于全自动多样品快速浓缩仪中氮吹至干，水浴温度为40 ℃。定容：吸取1 mL乙腈复溶，涡旋均匀，上机测定。

1.3.4 线性关系、检出限和定量限

标准工作液经HPLC-RF系统分析，以标样质量浓度为X轴，目标物的峰面积为Y轴，绘制标准曲线。根据信噪比（S/N）=3，计算方法检出限（LOD），信噪比（S/N）=10，计算方法定量限（LOQ）。

1.3.5 加标回收和精密度实验

随机选取1份样品作为空白，进行加标验证试验，并分别称取该样品2份，一份作为本底值检测，另一份作为加标回收，加入适量标准液，添加0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13个浓度水平进行加标回收实验。同时为考察方法的重复性及稳定性，进行日内和日间精密度试验，于不同时间分别测定不同加标浓度为的猪血丸子样品，每次进行6次平行实验，计算加标回收率及相对标准偏差（RSD）。

1.4 数据处理

采用与LC-20AT仪器配套RF-20A（荧光检测器）进行样品分析，软件LabSolution-LCSolution进行数据采集及分析。采用Excel进行绘图及数据统计，所有实验结果以平均值表示，用SPSS软件对数据进行分析，采用T检验比较，P＜0.05视为有显著性差异，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取方式及时间的选择

考察了超声、振荡不同提取方式及在2 min、5 min、10 min、20 min和30 min不同提取时间对猪血丸子中BaP提取效率的影响，如图1。结果显示，超声和振荡提取效率基本一致，提取效果在10 min内随时间的增加而升高，时间为10.0 min，提取效率最佳，10.0 min后，提取效率趋于平稳。考虑到样品批量处理的便捷性，以及试验过程中若振荡方式不合理或者振荡速度过大造成样品提取液溢出等因素，试验采用超声提取。试验同时比较了超声提取次数对0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13 个不同质量浓度的加标样品BaP提取效率的影响，如图2。结果表明，提取2次的检测值及回收率基本与提取1次的保持一致，经方差分析T检验，提取次数之间无差异显著性（P＞0.05），无统计学意义，视为提取次数对提取效率影响小。综上，试验最佳提取方式为超声提取，提取时间为10.0 min，提取次数1次即可。

图1 提取方式及时间的选择图（n=3）

图2 提取次数的选择图（n=3）

2.1.2 固相萃取条件优化

（1）不同固相萃取柱比较。试验比较了亲水亲脂固相萃取柱（Waters Oasis，HLB，60 mg/3 mL）、中性氧化铝柱（Cleanert Alumina N，AL，100 mg/3 mL）、BaP分子印迹柱（Cleanert BAP-3，MISPE，500 mg/6 mL）在 0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13 个不同浓度水平下萃取柱的提取效率，以加标回收率表示，如图3。

图3 固相萃取柱的选择图（n=3）

结果显示，各固相萃取柱表现基本稳定，MISPE提取效率高于其他2种，HLB相对较差。在试验过程中发现，采用中性氧化铝柱时，试剂消耗量大，而分子印迹柱试剂消耗小，操作更加简便。因此试验采用分子印迹柱进行净化处理。

（2）淋洗液比较。分子印迹柱具有专一识别的特点，但在富集BaP目标物的时候也可能存在非特异性吸附，为提高分析印迹填料结合位点和BaP分子之间的选择性作用，试验优化淋洗液的条件，考察了甲醇、乙腈、正己烷3种常见的淋洗液对质量浓度为10.20 μg·kg-1的加标样品BaP提取效率的影响。结果显示，正己烷的淋洗效果最好，回收率为94.6%，保留分子印迹对BaP的吸附能力，且能有效去除油脂等杂质，甲醇和乙腈选择性不佳，回收率分别为82.2%、86.9%，可能是淋洗液洗脱强度太强，造成了一定量目标分析物的损失，故试验选择正己烷为最佳淋洗液[5]。

（3）洗脱液比较。洗脱液是为了解除目标物BaP和分子印迹填料结合位点之间的相互作用，从而获取高富集因子（EFs）[6]。EFs表示在样品萃取前后，洗脱液中目标物的浓度（Cexp）与初始样品中目标物的浓度（C0）的比值，即EFs=Cexp/C0[7]。试验考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷3种常见的洗脱液对质量浓度为10.20 μg·kg-1的加标样品BaP的提取效率的影响。结果显示，甲醇、乙腈的洗脱效果不佳，回收率仅为80%左右，二氯甲烷效果最好，回收率为98.5%，可能是二氯甲烷与BaP有较好的相似相溶性，选择性强，且分子印迹柱在该萃取条件下，BaP的富集因子（EFs）为20，表明优化后的萃取方法有良好的浓缩效果，故试验选择二氯甲烷为最佳洗脱液。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

为使目标分析物有更好的分离度，试验考察了95%、88%、85%和80%不同体积分数的乙腈溶液对样品的分离效果。结果表明，流动相的乙腈水比例为88∶12效果最好，目标物与干扰物的分离度好，出峰时间在11 min左右。

2.2.2 色谱柱的选择

试验比较了TC-C18柱、Scientific Hypersil Green PAH柱对BaP色谱图出峰的影响情况。结果显示，Scientific Hypersil Green PAH对BaP具有较好的保留，其高碳载量的特殊定制烷基键合硅，适合用于分析BaP等分子极性小得多环芳烃类物质，得到的色谱图基线噪音小、峰形对称、宽度较窄及不拖尾。

根据2.1和2.2优化后的前处理条件和色谱条件，对BaP标准溶液（20.40 ng·mL-1）和猪血丸子实际样品进行测定，得到图4的色谱图，故试验采用PAH柱。

图4 BaP色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限和定量限

对MISPE结合LC-RF方法的线性、检出限（LOD）、定量限（LOQ）进行研究，结果见表1。结果表明BaP标准溶液在 5 个浓度水平 0.51 ng·mL-1、1.02 ng·mL-1、5.10 ng·mL-1、10.20 ng·mL-1、20.40 ng·mL-1的峰面积和质量浓度的回归方程线性关系良好，相关系数达0.999 66，BaP 的LOD和LOQ分别是 0.2 μg·kg-1和 0.5 μg·kg-1。

表1 方法的线性方程、检出限（LOD）和定量限（LOQ）表

2.3.2 精密度和回收率

按照上述优化后的前处理方法及色谱条件进行回收率和精密度试验，每个添加水平做6次平行，结果如表2所示，3个浓度水平下BaP的日内精密度RSD为2.7%～3.6%，日间精密度RSD为3.9%～4.4%，表明方法的精密度和重复性良好。通过样品加标，BaP的方法回收率在97.3%～102.8%，回收率较高，RSD为3.1%～4.6%。根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F.4要求，添加水平小于100 μg·kg-1时，加标回收率范围应在60%～120%，其精密度应＜15%，试验表明，该方法的加标回收、日内和日间精密度符合要求，结果准确可靠。

表2 方法的精密度及回收率表（n=6）

2.4 实际样品的测定

由表3知，采用试验开发的MISPE结合HPLC-RF方法对市售的20批次猪血丸子中BaP进行检测，对数据进行统计分析。结果发现，市售猪血丸子的BaP检出率为80.0%，1批次高达17.7 μg·kg-1。以《猪血丸子》（DB 43/346—2007）的限量要求≤ 5.0 μg·kg-1为判定依据，猪血丸子样品问题检出率为30.0%。图4为空白基质、标准工作液（20.40 ng·mL-1）及样品色谱图，标准图谱和样品图的相对保留时间保持一致，符合定性要求。

表3 猪血丸子实际样品测定结果表（n=3）

3 结论

试验建立了MISPE结合HPLC-RF检测猪血丸子中BaP的方法，对样品的提取条件及MISPE净化条件进行优化，达到显著的富集及净化效果，同时优化了色谱条件，得到较高的检测灵敏度和重复性。方法学验证结果表明BaP在0.51～20.40 ng·mL-1范围内线性关系良好，相关系数R2=0.999 66，加标回收率在97.3%～102.8%，相对标准偏差（n=6）均小于5%，方法定量限（S/N=10）为0.5 μg·kg-1。通过实际样品检测，猪血丸子中BaP检出率达80.0%，样品问题检出率为30.0%，最高检测值高达17.7 μg·kg-1。综上所述，方法操作简单，灵敏度高，精密度好，试剂消耗小，结果准确可靠，适用于猪血丸子中BaP的日常检测分析，相关数据可为行政监管部门提供依据及参考，具有实际应用价值。