微流激光生化传感技术综述

王朝钦，宋昊玥，杨 熙，王艳琼，龚 元

1.电子科技大学信息与通信工程学院，四川成都611731

2.电子科技大学光纤传感与通信教育部重点实验室，四川成都611731

流激光集成液体增益材料和光学微腔，常用作传感器或片上光源。区别于传统的固体激光器，微流激光集成了微流体系并采用流体状的增益介质，具有激光阈值低、集成度高、波长可调、功能多样等特点。相较于无源微腔和其他光流控检测技术，激光微流控充分利用了增益介质的放大作用，增强了光和物质的相互作用，结合微腔实现激光出射。以激光信号作为输出，具有以下优势：1）利用光学微腔和激光的放大作用，增强光和物质的相互作用，实现较高的灵敏度；2）激光具有方向性，相较于无方向性的荧光信号，其强度更强，具有较高的信噪比；3）激光线宽更窄，可实现更高的波长复用度，有利于实现高通量的生化传感。

微流激光作为生化传感领域的热门技术，是微流技术与光学相结合的热点方向和学科前沿[1-2]。在微腔结构方面，2003年，Helbo 等[3]利用两块平面反射镜构成法布里-珀罗腔，实现了第一个片上微流激光器；Bhaktha 等[4]利用微流芯片通道壁上的随机结构提供随机反馈，实现了随机微流激光。结合选择性填充技术，Yu 等[5]基于反谐振光纤的微环谐振腔实现了激光输出。Zhou 等[6]在硅基底上生长量子点实现了单纵模激光，利用光子晶体激光对环境温度及表面电荷变化的敏感性，可实现折射率传感。

在增益介质方面，基于有机染料，Moon 等[7]将裸光纤深入填充装有罗丹明溶液的毛细管中，在泵浦脉冲的作用下观察到了激光输出；Kazes 等[8]将量子棒作为增益介质，以通信光纤作为谐振腔，利用光纤微腔的高Q 值克服了非辐射损耗，实现了微流激光输出；Schafer 等[9]利用CdSe/ZnS 量子点形成10∼40 µm 的液滴微腔，实现了单模和多模的激光发射；Gather 等[10]利用大肠杆菌内基因编码的绿色荧光蛋白作为增益介质，实现了激光发射；Lee 等[11]将维生素B2 的水溶液作为增益介质，实现了生物相容的光微流激光。将激光粒子（laser particles, LPs）注入到细胞中并以泵浦激发，可实现细胞激光器[12-14]，通过收集其发射出的激光信号可以完成对LPs 的定位；Nicola 等[15]基于此原理完成了对肿瘤中数千个细胞的轨迹追踪。

本文围绕微流激光生化传感技术的基本原理，分别介绍了基于增益介质调节、基于微腔调节和基于损耗调节的生化传感。其中，基于增益介质调节的生化传感是目前主流的微流激光生化传感原理，应用范围最广，也是本文重点讨论的内容。例如，当待测物直接或间接影响增益分子的数量或状态，将会导致激光输出特性变化。通过标定激光输出特性与待测物浓度之间的关系，则可对待测物含量进行传感测量。基于微腔变化的生化传感也是本文讨论内容之一，待测物引起微腔尺寸或形状的变化，从而引起激光输出特性的变化，如激光波长。最后，阐述了基于损耗调节的生化传感。待测物调节腔内的吸收损耗或散射损耗，使得激光输出强度发生变化。

1 基于增益介质调节的微流激光生化传感技术

微流激光器由谐振腔、增益介质和泵浦构成。泵浦为系统提供能量、激活增益介质、实现粒子数反转，进而实现光放大。谐振腔可以增强光和物质的相互作用，因此基于微流激光的传感器能灵敏地反映激光腔内待测物分子的数量和状态的变化。通过生化反应，使待测物分子的数量能够直接或间接影地响增益介质的数量或状态，是微流激光传感领域中最常用的一种方式。

1.1 基于增益分子数量变化实现生化传感

在生化传感应用中，常利用生物化学的方法使增益分子与待测物之间建立直接或间接的一一对应关系。待测物的数量可以决定在光学微腔中总的增益分子的数量。增益分子的数量又决定了激光输出特性，则通过对微流激光器的输出可实现待测物浓度的传感。

免疫检测“金标准”酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是将一定浓度的抗原或抗体固定于固相载体表面，加入待检样本后通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或抗体的存在与否或量的多少，如图1(a) 所示。Wu 等[16]提出了微流激光ELISA，通过将传统的双抗体夹心ELISA 方法与光学微腔结合，先将捕获抗体交联于方形毛细管内表面，再把待测物通入毛细管孵育，使其与固定在方形毛细管上的捕获抗体相交联，如图1(b) 所示。用清洗液除去未结合的分子，再让特异性识别待测物的检测抗体通入毛细管内孵育，使固定在捕获抗体上的待测物分子与检测抗体特异性结合。用清洗液清洗后，让链霉亲和素标记的过氧化氢酶（SAv-HRP）溶液流过方形毛细管并孵育，使SAv-HRP 分子与检测抗体相交联。由于抗体与抗原交联的特异性，只有成功捕获到待测物的抗体位点才能存在检测抗体，并与SAv-HRP 分子特异性结合。与待测物分子结合的抗体位点越多，捕获到的SAv-HRP 分子数量也就越多。完成了对方形毛细管的处理后，将无色透明的底物溶液通入毛细管内并用泵浦激发。待测分子数量的多少决定了固定在光学微腔表面的HRP 数量，HRP酶的数量又决定了催化底物产生荧光产物的效率，具体表现为激光出射时间的长短，如图1(c)所示。因此，通过测量激光出射时间，就能够完成对待测物的传感。

图1 微流激光ELISAFigure 1 Optpfluidic laser-based ELISA

基于同样的表面固定原理，Mao 等[17]探索了表面位点对检测性能的影响，实现了基于光纤微流激光的HRP 检测。以一次性空心光纤（hollow optical fiber, HOF）作为光学微腔，研究了纳米粒子对传感灵敏度的提升作用。将HOFs 生物素化处理后分为3 组，包括对照组、Au 纳米棒和SiO2纳米颗粒组，如图2(a)所示。其中，Au 纳米棒和SiO2纳米颗粒组的表面更丰富，可提供更多的SAv-HRP 结合位点，这也导致了HOFs 的表面体积比发生变化。再用缓冲液稀释成不同浓度的HRP 通入3 组具有不同表面体积比的HOFs 内孵育，SAv-HPR分子与表面位点特异性结合形成亚单分子层覆盖在HOFs 的内表面。向处理好的HOFs 内通入无色底物溶液，HPR 酶会与无色底物溶液发生反应产生增益介质。在相同催化时间下，增益介质的浓度取决于光纤表面固定的SAv-HPR 分子数量，因此在一定的实验装置以及光学微腔下，孵育固定的SAv-HRP 分子数目决定激光的输出。研究表明，SAv-HRP 分子的浓度与30 min 时激光的积分强度之间有较好的线性关系。如图2(b) 所示，纳米粒子对传感灵敏度的提升作用显著。当Au 纳米棒存在时，传感灵敏度提升了23.3%；在SiO2纳米棒存在时，传感灵敏度提升了57.4%。为排除通过非特异性吸附到光纤内壁的SAv-HRP 分子对实验的影响，该工作设置了空白组，无激光激发，实验结果证明通过非特异性吸附到光学微腔内表面的分子数量是可以忽略的。

图2 基于空心光纤的HRP 检测Figure 2 HRP detection based on hollow fiber

待测物除了结合在光学微腔表面外，还可以在体溶液中进行检测。例如，Gong 等[18]提出酶催化微流激光，实现了高性能的离子传感。酶催化微流激光的实验装置如图3(a) 所示，用两块高反镜平行放置构成法珀腔，位于两块高反镜之间的方形石英毛细管作为微流通道实现液体流入和流出。在酶催化微流激光传感器中，采用HRP 催化无荧光透明底物生成的荧光产物作为微流激光器的增益介质。硫离子会抑制HRP 的活性，从而间接地影响激光发射进程，反应体系中硫离子的浓度越高，则酶的活性越低，荧光产物浓度增加速率放缓，使激光出射时间延长，如图3(b) 和3(c) 所示，激光出射时间与反应体系中硫离子的浓度相关，则通过测量激光出射时间，可实现硫离子的浓度传感。最终实现了探测下限为10 nM，动态范围为3个量级的硫离子浓度传感，如图3(d) 所示。

图3 酶催化微流激光用于硫离子传感。(a) 微流激光离子传感器装置示意图；(b) 酶催化微流激光传感原理示意图；(c) 激光输出强度与时间的关系曲线；(d) 硫离子标定曲线Figure 3 Enzyme catalyzed optofluidic laser for sulfur ion sensing.(a) Schematic diagram of optofluidic laser ion sensor device;(b)schematic diagram of enzyme catalyzed optofluidic laser sensing principle; (c) relation curve between laser output intensity and time; (d)calibration curve of sulfur ion

1.2 基于增益分子状态变化实现生化传感

在荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）传感原理中，当一个荧光分子（又称为供体分子）的发射峰与另一个荧光分子（又称为受体分子）的吸收峰重叠时，供体分子可将能量转移给受体分子使供体分子光强减弱，受体分子发光。传统的FRET转换效率受分子间距离调控，工作距离仅在10 nm 以内。在微流激光中，将供体-受体对置于光学微腔内，并以此实现激光发射。将供体和受体分别交联于蛋白质等大分子的两端。当生物大分子发生形态变化时，供体和受体之间的距离会发生变化，能量转移效率改变，影响输出光的波长成分。通过分析输出光的光谱，便可通过供受体之间的波长转换效率来反映蛋白质的形态变化。Fan 团队[19]在Holliday 结构DNA 的4 个臂上分别交联青色素染料Cy3 和Cy5分子作为供体/受体对，当镁离子浓度增加时，Holliday 结构DNA 逐渐折叠，转化为堆叠的X 型结构，如图4(a) 所示。Cy3 和Cy5 分子间的距离减小，能量转换效率变大。波长逐渐从Cy3 发射峰转移至Cy5 发射峰。通过检测Cy3 和Cy5 的输出波长转换比例，可精确地反映样本中镁离子的浓度，如图4(b) 所示。此外，利用波长转换的特性，该团队还制作出可完全由生物方法调节输出波长的激光器，通过调节镁/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的比例，使得激光器的输出在两种波长之间切换，且输出波长切换是可逆并可重复进行的。

图4 Holliday 结构DNA 用于镁离子检测Figure 4 Holliday structure DNA for magnesium ion detection

通过控制增益分子的激发/淬灭状态，也可以实现待测物的传感。Wu 等[20]利用该原理，基于具有donor-acceptor-donor 结构的富电子染料实现了用于爆炸物检测的微流激光传感器，完成了对二硝基甲苯（DNT）的传感。DNT 在化学上是缺电子炸药，与富电子荧光染料相互作用时会产生荧光淬灭效应。将方形毛细管夹在2 个反射率分别为91.5%（上）和99.5%（下）的反射镜之间，高反镜提供光反馈，毛细管作为微流通道，如图5(a) 所示。将富电子荧光染料与DNT 溶液混合后注入光学微腔，由于DNT 对荧光染料的淬灭作用，能正常参与激光发射的荧光染料分子数与DNT 的浓度呈负相关，进而根据其激光积分强度来确定DNT 的浓度。如图5(b) 所示，该工作实现了检测下限10 nM，动态范围超3 个量级的高性能传感。

图5 基于激光淬灭的爆炸物传感Figure 5 Explosive sensing based on laser quenching

类似地，微流激光也可以与DNA 熔解曲线分析技术相结合，通过控制染料分子与DNA双链结合与释放这两种状态，可以完成对DNA 碱基失配数量的判断。如图6(a) 所示，当染料分子与双链DNA（dsDNA）结合时具有较强的荧光。随着温度的升高，双链DNA 解离成单链DNA（ssDNA）。染料从双链DNA 链中释放出来，其荧光减弱。在DNA 熔解曲线分析中通过检测荧光强度作为温度的函数，得到DNA 熔解曲线，该曲线取决于两条结合DNA 链之间的亲和力，亲和力又取决于DNA 的长度和序列，以及碱基错配的数量。通过对比熔解曲线，就可以判断出碱基失配的数量。Lee 等[21]利用激光腔提供的光反馈来放大热动力学差异，将DNA 样本和饱和染料放置在微流激光器微腔中进行腔内检测，如图6(b) 所示。用激光代替荧光作为传感信号，实现了单碱基失配DNA 的区分，如图6(c) 和6(d) 所示。

图6 基于微流激光的DNA 熔解曲线分析技术。(a) DNA熔解曲线分析原理图；(b) 实验装置示意图；(c) 温度与激光阈值的关系；(d) 温度与输出激光强度的关系Figure 6 DNA melting curve analysis technology based on optofluidic laser.(a)DNA melting curve analysis schematic diagram; (b) schematic diagram of experimental device; (c) relationship between temperature and laser threshold; (d)relationship between temperature and output laser intensity

2 基于微腔调节的微流激光生化传感技术

在微流激光生化传感中，可以通过对微腔进行调节实现传感。目前基于微腔调节的微流激光生化传感技术主要分为两种：一种是调节谐振腔的尺寸，另一种是调节谐振腔的结构。谐振腔的改变会引起谐振频率或波长改变，标定其与被测物浓度之间的对应关系，可实现对被测物浓度的定量检测。

2.1 基于谐振腔尺寸变化实现传感

在基于谐振腔尺寸变化实现生化传感中，可以通过机械手段对谐振腔进行拉伸，改变谐振腔的大小，实现激光波长的调节，构建可调谐微流激光器。Tang 等[22]利用高Q 值的微泡腔，成功构建了阈值为7.8 µJ/cm2、线宽约为0.1 nm 的微流激光器，如图7(a) 所示。用共轭聚合物（CN-PPV）作为增益材料，通过横向拉伸谐振腔，实现对谐振频率的微调，构建可调谐微流激光器。

图7 通过谐振腔尺寸变化实现传感Figure 7 Sensing by changing the size of the resonator

微流激光器具有利用机械拉伸实现激光频率调谐的潜力。机械拉伸可改变空心气泡谐振腔的尺寸，通过对回音壁模式（WGM）微腔的几何边界条件改变与应变诱导折射率改变，实现对谐振波长的微调。将谐振腔的一端用UV 胶固定，另一端用仪器对其进行拉伸。研究发现，微流激光器的波长随着毛细管的拉伸发生漂移，如图7(b) 所示。当拉伸长度超过54 µm时，激光波长可超出自由光谱范围。尽管拉伸长度较长，但输出的激光强度稳定且持久。共轭聚合物因其优异的光稳定性、较大的消光系数和较低的细胞毒性，在生物分析与成像方面引起了广泛关注。与典型的染料激光器相比，微泡腔中共轭聚合物填充的微流激光器具有更好的光稳定性，可增加生化分析的可靠性与灵敏度，为微流激光器在生物传感和医学诊断领域的进一步发展提供了可能。

2.2 基于谐振腔结构变化实现生化传感

在基于谐振腔结构变化实现生化传感中，可以通过改变分子取向实现生化传感[23]。Li等[24]提出了一种基于WGM 的新型液晶微光纤生物传感器，通过改变液晶分子取向，引起微腔结构变化，激光波长发生漂移。通过波长的漂移量可以表征脂肪酶浓度。

液晶光纤的基底材料为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），表面为一层4-氰基-4′-戊基联苯（5CB）分子。微光纤表面的甘油三油酸酯在脂肪酶的催化下生成油酸。一般情况下，因为甘油三油酸酯的疏水性不能在液晶表面自发形成一层单分子层，使液晶分子处于平面排列状态，如图8(a) 与8(b) 所示。当脂肪酶存在于溶液中时，生成油酸，使得液晶分子取向由平面排列变为垂直排列，如图8(c) 所示。由于液晶分子的各向异性，当液晶分子取向改变时，介电常数会发生改变，使谐振波长发生漂移。因此，通过波长的漂移量可表征脂肪酶浓度，检测下限为0.01 µg/mL，如图10(d) 所示。基于WGM 的液晶微光纤微流激光可以灵敏地响应微腔结构的变化，将波长漂移量作为传感参量，实现对脂肪酶浓度的检测。

图8 脂肪酶与甘油三油酸酯发生酶促反应前后液晶光纤中5CB 分子取向示意图。(a)∼(b) 平面取向；(c) 垂直取向；(d) 波长漂移量与脂肪酶浓度变化的关系Figure 8 Orientation of 5CB molecule in liquid crystal optical fiber before and after the enzymatic reaction between lipase and triglyceride.(a)∼(b) Plane orientation; (c) vertical orientation; (d) relationship between wavelength shift and lipase concentration

3 基于损耗调节的微流激光生化传感技术

在微流激光生化传感的应用中，除了检测增益介质、微腔的变化之外，也可以通过微腔内不同的损耗实现传感。与待测物相关联的物质对激光产生吸收或散射效应，会使激光强度下降，从而实现待测物的传感。目前基于损耗调节的微流激光传感技术主要分为两种：一是基于散射损耗传感，二是基于吸收损耗传感。激光腔增强了光和物质的相互作用，可放大吸收损耗和散射损耗，进而提升传感的灵敏度。

3.1 基于散射损耗实现生化传感

在传统的免疫比浊法中，抗体与其抗原混合形成抗原抗体复合物（AACs）。在促聚剂的作用下从液相析出，形成悬浮于液相中的微颗粒，溶液会出现一定的浊度，对光有吸收、散射和反射作用，使光强减弱。Yang 等[25]将微流激光技术与免疫比浊法结合，提出微流激光免疫比浊法，如图9(a) 所示。在抗体过量的情况下，抗原浓度不同，形成的AACs 的尺寸和浓度也随之发生变化，产生的损耗也不同，则可通过检测光强来表征抗原浓度（如图9(b) 所示）。利用光学微腔和激光增强了光与物质的相互作用，实现了高灵敏的蛋白质传感。以激光强度作为传感参量，实现了5 个数量级的动态范围，以及0.18 pg/mL 的极低检测下限。与传统单次透射法和腔增强荧光法相比，微流激光免疫比浊法得益于微腔和激光的放大作用，具有较高的检测灵敏度。

图9 微流激光免疫比浊法Figure 9 Optofluidic laser immunoturbidimetry

此外，Yang 等[25]在研究一次性微流激光传感器时，也采取了散射损耗调节的方案。将IgG 标准溶液与Tris-PEG 缓冲液混合并孵育，记为A 溶液。再将抗体溶液加入A 溶液中，孵育并静置，获得免疫复合物悬浮液，记为B 溶液，最后将RhB 溶液与B 溶液按1∶9 的体积比混合，吸入HOF，立即记录激光输出。抗原和抗体特异性结合，并在PEG 的辅助下形成不溶于水的免疫复合物，如图10(a) 所示。随着反应时间的延长，免疫复合物的大小和浓度都会增加。当免疫复合物的尺寸达激光波长的1/30∼1/6 时，根据瑞利散射理论和Beer-Lambert定律，HOF 内的免疫复合物引起吸收、散射和反射损耗以衰减激光输出，以激光强度作为传感输出，可以在10 min 内完成蛋白质检测，如图10(b) 所示。

图10 基于微流激光的一次性免疫传感Figure 10 Disposable immunosensor based on optofluidic laser

3.2 基于吸收损耗实现生化传感

通过吸收损耗调节激光输出特性实现传感，也是实现微流激光生化传感的一个途径。不同浓度的待测物对激光的吸收能力不同，对比激光通过待测物前后的强度就可以完成对待测物的传感。为产生较强的吸收损耗，通常将激光波长优化至待测物的吸收带。基于此，Gong等[26]实现了分布式光纤微流激光器，用于高通量生化传感。利用沿光纤轴向连续分布的微环谐振腔作为一维光源，在其上方集成5 根方形石英毛细管作为样品通道，如图11(a) 所示。光纤出射的激光可以被毛细管内部的反应物吸收，导致透过毛细管后摄像机接受到的激光强度下降。通过计算分布式光纤微流激光器输出信号的透射率变化，就可以实时监测每个通道的反应过程[20]。根据重吸收效应，通过调节下方光纤激光器增益介质的浓度可以实现输出波长调节，使其与上方方形石英毛细管中产物的吸收峰相对应。在方形石英管中，放置HRP 酶和无色底物TMB 的混合物，二者混合后会逐渐变成蓝色，其吸收强度会随着反应的进行而增大，根据Beer-Lambert 定律，传感通道的透射率减小。以透射率降低到初始值的90%的时间作为传感信号。图11(b) 为不同HRP 浓度下，归一化光透过率随反应时间变化的关系曲线。结果表明，该方法通过调节吸收损耗，成功实现了14 pM 的检测下限，并实现了阵列化的酶浓度传感。

图11 分布式光纤微流激光用于高通量传感Figure 11 Distributed fiber microfluidic laser for high throughput sensing

4 结 语

本文综述了微流激光生化传感的主要机理，并从增益分子、微腔、损耗3 个角度阐释了微流激光的传感原理。利用增益分子的数目和状态变化，微腔的尺寸与形状变化，激光的散射与吸收损耗等都可以完成高灵敏度的生化传感。微流激光传感相对于传统的荧光传感而言，在信号产生原理和输出特性上有着本质的不同，这使得微流激光在灵敏度、光谱复用度、成像空间分辨率和生物相容性等方面有着独特的优势。微流激光技术与最新的生化检测技术相结合，有望开拓出更多新的应用领域。