妊娠期肝内胆汁淤积症患者外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞变化及意义*

郑皓文，曹智伟，马 莉，傅 丹，孔 祥**

（1连云港市第一人民医院妇产科，江苏 222000；扬州大学2医学院，3临床医学院）

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是发生在妊娠中晚期的疾病，母体出现皮肤瘙痒，血液中总胆汁酸明显升高和肝功能异常等，严重时会发生胎儿宫内窘迫、甚至胎儿死亡[1-2]。ICP病因目前尚不完全清楚，可能与遗传、激素水平异常和环境等因素相关[3-4]。近年来，有研究发现孕妇免疫系统异常可能导致多种妊娠相关疾病[1，5]，如流产、胎儿发育异常和子痫前期。Th17和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）细胞是近年发现的Th细胞亚群，对妊娠期免疫功能变化发挥重要作用[6-8]。本研究选择苏北人民医院2018年6月—2020年5月诊治的ICP患者38例，探讨外周血Th1、Th2、Th17和Treg细胞数量变化及其在ICP发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 ICP患者38例，均为单胎，分为轻度ICP组30例，重度ICP组8例。ICP诊断标准参照中华医学会妇产科学分会产科学组妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南（2015）[9]，ICP严重程度的判断:（1）轻度:血清总胆汁酸10.0～39.9μmol/L；临床症状以皮肤瘙痒为主，无明显其他症状。（2）重度:血清总胆汁酸≥40μmol/L；临床症状严重伴其他情况，如多胎妊娠、复发性ICP、既往有因ICP的死胎或新生儿窒息病史。选择同期正常单胎孕妇30例作为对照组。正常组和轻、重度ICP组孕妇年龄分别为27.03±3.92岁、27.93±4.10岁和27.87±3.68岁，孕次1.73±0.98次、1.63±0.85次和1.63±0.85次，产次0.73±0.81次、0.63±0.74次和0.50±0.63次，采样孕周31.82±1.92周、32.93±1.87周和32.87±2.03周，差异均无统计学意义（P＞0.05）。而分娩孕周分别为39.13±1.11周，36.63±1.62周和33.75±1.90周，差异有统计学意义（P<0.05）。排除胎儿异常、合并甲状腺疾病、高血压、糖尿病及其他原因引起的肝脏损伤。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 检测方法 清晨取患者空腹肘静脉血，EDTA抗凝，加入等体积Hanks液，吹打混匀后采用Ficoll密度梯度离心法获得单个核细胞。采用DxFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）及PE-CD4、PE-IL-4、PE-IL-17A、PE-CD127、PE-IFN-γ、FITC-CD8、FITC-CD25、PC5-CD3及PC5-CD25荧光素标记抗体（美国Beckman Coulter公司）。取2×105个单个核细胞重悬，加入相应荧光标记抗体，25℃～28℃避光孵育20 min，以PBS洗涤和重悬，上流式细胞仪进行测定。Th1细胞数量以CD4+IFN-γ+细胞占CD4+T细胞的百分比表示，Th2细胞数量以CD4+IL-4+T细胞占CD4+T细胞的百分比表示，Th17细胞数量以CD4+IL-17+T细胞占CD4+T细胞的百分比表示，Treg细胞数量以CD4+CD25+CD127low/-T细胞占CD4+T细胞的百分比表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组外周血Th1、Th2细胞比例比较 轻度ICP组和重度ICP组外周血Th1细胞比例高于对照组，重度ICP组Th1细胞比例高于轻度ICP组，差异均有统计学意义（P<0.05）；轻度ICP组和重度ICP组外周血Th2细胞比例低于对照组，重度ICP组Th2细胞比例低于轻度ICP组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 三组Th1、Th2细胞比例比较 （%）

2.2 三组外周血Th17、Treg细胞比例比较 轻度ICP组和重度ICP组外周血Th17细胞比例高于对照组，重度ICP组Th17细胞比例高于轻度ICP组，差异均有统计学意义（P<0.05）；轻度ICP组和重度ICP组外周血Treg细胞比例低于对照组，重度ICP组Treg细胞比例低于轻度ICP组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 三组Th17、Treg细胞比例比较 （%）

2.3 三组外周血Th1/Th2和Th17/Treg比值比较 轻度ICP组和重度ICP组Th1/Th2和Th17/Treg比值高于对照组，重度ICP组Th1/Th2和Th17/Treg比值高于轻度ICP组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 三组Th1/Th2和Th17/Treg比值比较

3 讨 论

全球ICP发生率1%～15%[1-2]，中国ICP发病率为0.8%～12.0%[10]。ICP主要临床表现为在妊娠中晚期孕妇皮肤瘙痒，血液总胆汁酸水平或肝功能转氨酶升高，患ICP的女性在远期更易发生胆囊炎、胆固醇胆结石、非酒精性肝硬化、肝癌以及免疫介导的心血管疾病[1-6]。ICP对胎儿危害性较大，可能发生胎儿发育迟缓、羊水胎粪污染、早产、胎死宫内，可引起婴儿出生后呼吸窘迫综合征，入住ICU抢救率升高[6-8]。国内外研究发现ICP发病机制涉及多因素，可能与孕妇内分泌激素失调、妊娠期免疫因素改变、炎症反应和遗传变异有关[10-11]，免疫失衡可能是引起ICP的原因之一[6-7]。

妊娠可看成是同种半异体移植过程，成功与否取决于母体与胎儿间的免疫平衡，一旦平衡失调，则导致妊娠失败或病理妊娠。CD4+T细胞及其相关细胞因子在母胎免疫识别和耐受中发挥重要作用，T细胞免疫反应贯穿整个妊娠期[6-8]。Th1、Th2、Th17和Treg细胞是CD4+T细胞的四个亚群，其中Th1和Th2为最先发现的Th亚型，在Th17、Treg发现前被认为是组成辅助性T细胞的两大主体。Th1细胞因子包括IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-1β，这些细胞因子通过激活巨噬细胞产生活性氧中间产物和NO，刺激巨噬细胞吞噬功能，增强其抗原提呈能力，诱导免疫毒性和免疫杀伤，在抗肿瘤、抗病原菌及免疫排异中发挥作用[6-8]。Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，有效地帮助B细胞激活，免疫球蛋白向IgE和IgG1转换，并下调巨噬细胞活化[12-14]，Th2细胞诱导免疫防护或免疫营养，在调节自身免疫疾病发展中起到关键作用。

在正常妊娠期母体Th1/Th2相关细胞因子保持平衡状态，以保持对胎儿的耐受和保护。Th1/Th2免疫反应异常可能与妊娠相关疾病的发病有关[15-16]，Th1/Th2细胞比例失调会导致妊娠期疾病和自身免疫性疾病的发生[6-8]。最近研究表明，ICP患者出现免疫反应失调，胎盘中免疫反应异常[16]。本研究发现ICP患者外周血中Th1细胞比例显著上升，而Th2细胞比例显著下降，这种Th1/Th2平衡失调可导致相关细胞因子的变化。LARSON等[6]研究发现，ICP患者Th1相关炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-18增加，而Th2相关抗炎因子IL-4、IL-10等减少，导致免疫平衡向Th1漂移。ICP患者的总胆汁酸水平升高产生胆汁淤积，引起促炎细胞因子进入血液循环，积聚在肝脏中，可能导致肝损伤[17]。

近年来，妊娠免疫理论Th1/Th2模式已发展为Th1/Th2/Th17/Treg模式[6-7，18]。研究发现，Th17细胞在动物模型和人类疾病中都能介导炎症和自身免疫反应[12，19]，诱导靶器官局部炎症，协助B细胞产生抗体。Th17细胞主要产生IL-17、IL-21和IL-22等细胞因子[20-21]。IL-17等Th17细胞因子与胎膜早破、宫内感染有密切关系。高水平IL-17与多种炎症因子发挥协同作用，增加胎盘毛细血管炎症反应，影响滋养细胞移行及侵入，导致胎盘浅着床，胎盘血流量减少。Treg细胞具有免疫抑制和免疫调节活性，其免疫抑制作用在母婴耐受机制中发挥重要作用。Treg细胞通过转化生长因子-β（TGF-β）调节Th1、Th2、Th17细胞，在诱导免疫耐受的同时参与免疫调节。Treg细胞具有维持妊娠自身免疫耐受功能，参与正常妊娠的免疫平衡，在胚胎着床及妊娠维持过程中发挥非常重要的作用。Treg细胞减少可影响妊娠期免疫耐受的形成，导致病理妊娠的发生[20-21]。在本研究中ICP患者外周血中Th17细胞比例显著升高，Treg细胞比例显著减少，说明ICP患者Th17细胞与Treg细胞免疫平衡失调。