不同种植年限铁观音茶树根系分泌物的GC-MS分析

李艳春，叶 菁,王义祥

(福建省农业科学院农业生态研究所/福建省红壤山地农业生态过程重点实验室，福建 福州 350013)

茶树(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)是我国重要的特色经济作物，但多年宿根连作后茶树会出现产量下降、品质变差的连作障碍问题[1-2]。化感自毒作用被认为是引起植物连作障碍的主要原因之一，探究自然连作状况下铁观音茶树根系分泌物组分和含量的动态变化，对进一步阐明铁观音茶树连作障碍机理有重要意义。据报道，宿根连作20年铁观音茶树的茶叶产量、光合速率和茶芽密度都比10年铁观音茶树显著降低了54.6%、13.3%和24.6%，茶鲜叶的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、儿茶素含量等品质指标也比10年铁观音茶树的显著降低[2]。目前普遍认为土壤理化性质改变、微生物群落结构失衡和化感自毒作用是引起植物连作障碍的3个重要原因[3-6]。关于茶树连作障碍问题，已有较多学者从根际微生态失衡方面进行研究并发现，随着铁观音茶树种植年限的增加，土壤微生物种类大量减少，结构更加单一[7]；假单胞菌、慢生根瘤菌、产黄杆菌等一些植物有益菌急剧减少，链格孢菌等植物病原菌数量却不断增多[8-9]。关于茶树根系分泌物的自毒作用方面，Ye等人[10]研究指出，铁观音、本山、黄棪茶树连作9年后根际土壤中积累了较多的自毒物质，被认为是引起茶叶品质下降、产量降低的重要原因。Arafat等[11]认为根系分泌物中的(+)-儿茶素对铁观音茶树根际细菌群落结构变化有较大影响。Kaur等人[12]认为，植物根系分泌的自毒物质在土壤中发生了土壤吸附、微生物分解等物理、生物变化过程，可能并不是在前后茬作物间直接产生毒害，而只是作为诱因通过改变根际微生态平衡间接地影响植物的生长发育。因此，一些学者认为根系分泌物的间接生态效应及其引起的土壤微生态结构失衡是导致植物连作障碍的主要因素[13-15]。目前对于宿根连作铁观音茶树根系分泌物的研究较少，自然连作状况下茶树根系分泌物组分、含量以及与微生物群落之间的关系尚不清楚，有待于进一步深入研究。针对铁观音茶树连作障碍问题，利用原位取土法收集不同宿根年限(0年、1年、10年、20年)的铁观音根际土，借助气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析和鉴定不同连作年限铁观音根系分泌物的化学组分及其含量变化，筛选影响连作障碍的关键根系分泌物，为进一步揭示铁观音茶树连作障碍机理提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以福建省安溪县感德镇定点观测试验站(25°18′N，117°51′E)内的铁观音茶树为研究对象，该区属亚热带季风气候，年平均气温15～18℃，年平均降雨量1700～1900 mm，是名茶铁观音主产区之一。选取海拔高度、坡向和坡位及管理水平基本一致的宿根连作1年、10年、20年的铁观音茶园各3个，每个茶园小区面积不小于15 m × 15 m，邻近未种植过茶树的荒地土壤作为对照。采用五点取样法进行根际土壤取样，方法如下：挖开茶树周边土壤，用小刀慢慢剥离根系上附着的土壤，离根系1 cm的土壤抖落下来为根际土壤。

1.2 根系分泌物的提取

将采集的根际土壤研磨过1 mm筛，精确称量5 g土壤置于50 mL的离心管中，加入30 mL 80%甲醇溶液(-20℃)，室温超声3 h，在4℃条件下3500 rpm离心10 min，取20 mL上清液到另一新的50 mL离心管中；再次往沉淀中加入20 mL 80%甲醇溶液(-20℃)，重复以上步骤，取15 mL上清液合并到上述50 mL离心管中，利用真空浓缩仪浓缩至2 mL；在4℃条件下3500 rpm离心10 min，取上清液1800 μL经过0.22 μm膜过滤，利用真空浓缩仪将其浓缩至尽干；加入甲氧基溶液100 μL后涡旋振荡持续30 s，在37℃条件下反应2 h；之后再加入BSTFA 试剂60 μL(含 1%三甲基氯硅烷)，37℃反应90 min，在4℃条件下12000 rpm离心10 min，吸取上清液转移至检测瓶中；从每个检测样本中吸取20 μL混合成为QC样本以校正误差；用剩余的待测样本用于GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析条件

气相色谱柱采用HP-5MS毛细管柱(5%苯/95%甲基聚硅氧烷，30 m × 250 μm × 0.25 μm)，载气：氦气，流速1 mL·min-1；进样体积：1 μL(分流比20∶1)；注射温度为280℃，接口设置为150℃和离子源调整到230℃。升温程序：初始60℃，持续2 min，10℃·min-1的速率升至300℃，持续5 min。质谱全扫描范围：35～750(m/z)。

1.4 数据统计与分析

利用G1701 MSD ChemStation软件将原始数据转成netCDF格式，利用R软件XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐，得到保留时间、质核比、峰面积等信息，利用AMDIS程序应用NIST质谱检索数据库和Wiley Registry代谢组数据库进行分泌物的注释。为便于不同量级数据的分析比较，将数据进行峰面积归一化。利用SIMCA-P(v13.0)和R语言ropls包进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、主成分分析(PCA)以及正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。采用t-检验和OPLS-DA相结合的方法进行差异代谢物筛选(VIP>1和P<0.05)。利用R语言pheatmap程序包进行聚类热图绘制。

2 结果与分析

2.1 GC-MS结果分析

通过GC-MS分析，首先得到不同种植年限铁观音茶树根系分泌物的总离子流图(图1)。4份根系分泌物成分的出峰时间和相对峰强度都有明显区别。

图1 不同种植年限铁观音茶树根系分泌物的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of root exudates from Tieguanyin tea plants grown under different years of continuous cropping注：Y0、Y1、Y10、Y20分别为宿根连作0年、1年、10年、20年的铁观音茶树。图2，图3同。

用GC-MS检测到铁观音根系分泌物中共有52种代谢物，其中有机酸13种(25%)、糖类11种(21%)、醇类16种(31%)、甾醇4种(8%)、酚酸类2种(4%)、二萜类1种(2%)以及其他有机物5种(10%)(表1)。用差异倍数(FC)表示初始值到最终值的变化程度，对差异倍数取对数表示差异的相对变化趋势。相对于0年(CK)，不同种植年限下铁观音根系分泌物的含量变化趋势见表1。

表1 不同种植年限铁观音茶树根系分泌代谢物成分及差异倍数

(接表1)

2.2 不同种植年限铁观音根系分泌物的PLS-DA分析

采用PLS-DA分析对不同种植年限铁观音根系分泌物的代谢组数据进行简化、降维和判别分析。结果表明：不同种植年限铁观音的根系分泌物呈现明显的分组，PLS-DA对于自变量X和因变量Y的拟合度分别为R2X=0.983，R2Y=0.991，预测度Q2=0.976，说明模型拟合效果较好(图2)。在200次的置换检验中随机排列产生的R2和Q2值都小于原始值，直线斜率大，表明PLS-DA模型没有出现过拟合，该模型较为可靠，能够依据VIP值筛选差异代谢物。

图2 不同种植年限铁观音根系分泌物PLS-DA得分及置换检验Fig.2 PLS-DA score map and model test results on root exudates from Tieguanyin tea plants grown under different years of continuous cropping

2.3 不同种植年限铁观音根系分泌物的差异代谢物筛选

为进一步找到不同处理间主要差异代谢物，根据PLS-DA第一主成分变量投影重要性值(VIP值)结合方差分析筛选差异代谢物(VIP > 1且P< 0.05)，得到18种主要差异代谢物(表2)。随着种植年限的增加，6个醇类化合物(2-单戊二酰甘油、2-单硬脂酰甘油、二十醇、二十九醇、木糖醇、甘露醇)、3个糖类化合物(肌醇半乳糖苷、异麦芽糖和麦芽糖)、以及4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、DL-β-羟基丁酸、十七烷酸的相对含量呈现上升的趋势。相反地， 4个糖类化合物(果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖)、十五烷酸、磷酸的相对含量随着种植年限的增加呈现出下降的趋势。

2.4 差异代谢物热图分析

将18种差异代谢物进行热图聚类分析(图3)。每一列代表一个样本，每一个格子代表一种代谢物，颜色深浅代表代谢物的含量高低。0年(CK)和1年聚在一起，10年和20年聚在一起，说明筛选出的差异代谢物能将各处理聚类区分开来。差异代谢物经过聚类也能聚成簇，说明每一簇代谢物可能参与了相同的代谢途径或者具有相似的功能。

图3 差异代谢物的热图聚类分析Fig.3 Heat map of differential exudate metabolites

3 讨论与结论

目前，对于不同种植年限铁观音茶树根系分泌物的鉴定以及含量动态变化的研究比较少。根系分泌物的提取大致有水培、土培、基质培养等多种方法。从根际土壤提取根系分泌物的方法与植物自然生长状态最接近，其优点在于由于土壤机械阻力的存在，根系分泌作用更加旺盛，根系分泌物的量要比液体培养条件下收集到的量更高[16]，该提取方法很容易受到土壤微生物代谢和分解的干扰，但是可以反映出在自然生长状况下植物根系分泌的真实情况。本研究表明，不同种植年限铁观音茶树根系分泌物中鉴定出的代谢物质主要有糖类、有机酸类、醇类、甾醇、酚酸、二萜类等，各类物质的相对含量随着种植年限的增加发生变化。

目前研究公认酚酸类物质是造成连作障碍的主要化感物质，苯甲酸及其衍生物已在多种作物中，如黄瓜、大豆等被确认为化感物质[17-18]；土壤中的对羟基苯甲酸含量随着花生连作年限的增加而增加[19]，邻苯二甲酸被认为是辣椒中的主要化感物质之一[20]；本研究中，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸随着铁观音连作年限的增加而增加，呈上调的趋势，是潜在的化感物质。已有研究发现，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸存在于地黄根际土壤中并且具有很强的自毒作用[21]。

根系分泌物是植物、土壤、根际微生物之间相互作用的重要媒介，能够为根际微生物提供营养和能量促进其生长和繁殖，同时也能够影响到根际微生物的种群数量和结构[22]。根系分泌物中的糖和糖醇被认为是很多微生物的能量来源以及通用的趋化性物质[23-25]。本研究中，果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖随着铁观音种植年限的增加呈显著下降的趋势，可能是引起根际微生物群落失衡导致连作障碍的趋化性物质，有待进一步研究。

利用GC-MS技术在不同种植年限的铁观音根际土壤中共检测并鉴定到52个根系分泌物，OPLS-DA分析表明，连作10年和20年的铁观音茶树根系分泌物差异较小，可与1年和0年根系分泌物明显区分开。共筛选到4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、果糖、半乳糖等18个组间差异显著的根系分泌物质。其中，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸是潜在的自毒物质，随种植年限的增加其含量显著增加；果糖、半乳糖、葡萄糖等随着铁观音种植年限的增加呈显著下降的趋势，可能是引起根际微生物群落失衡导致连作障碍的趋化性物质，有待进一步研究。