响应面法优化熏干草果油树脂提取工艺及成分分析

林 毅，黄 梅，吴桂苹 ，徐 飞，和俊才，友胜军，高鹏慧，刘霖娜，侯梅芳 ，谷风林

（1.上海应用技术大学, 生态技术与工程学院, 上海 201418；2.中国热带农业科学院香料饮料研究所, 海南万宁 571533；3.海南省特色热带作物适宜性加工与品质控制重点实验室, 海南万宁 571533；4.宁夏大学食品与葡萄酒学院, 宁夏银川 750021；5.怒江绿色香料产业研究院, 云南怒江 673200；6.怒江州农村科技与生产力促进中心, 云南怒江673200）

草果（Amomum tsaokoCrevost et Lemarie），姜科豆蔻属多年生草本植物，又称草果子、草果仁[1]，主要分布于我国的云南、广西、贵州等地区，种植范围达到全国90%以上[2]。在《本草品汇精要》中记载，草果形状犹如橄榄，皮较薄且颜色为紫色，果仁和缩砂仁相似，全株具有辛香气，喜在阴蔽、潮湿、土壤肥沃的环境中生长[3]。草果主要作为香辛料调味品，属于药食同源，不仅可以去除肉食腥、膻味，增加食品的香气风味，还兼具调节胃肠功能、降脂减肥、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防霉和抗炎镇痛等功效[4]。熏干草果（SDAT）主要是以成熟草果鲜果为原料，对草果鲜果淋喷后采用传统柴火加热房烘干[5]，得到表面黑红色SDAT。制备SDAT油树脂，其风味和香气成分要高于SDAT原料，并且SDAT油树脂包含了草果挥发油，且香气比挥发油更加丰富，又含有不易挥发的色素等成分[6]，使用范围比挥发油广。

近些年，随着草果产量的增大，其贮藏和运输成本不断增加，因此，将草果鲜果采用熏干的处理方式进行加工干燥，以便于贮藏和运输草果，从而降低草果生产成本。同时熏干的加工方式也会对草果化学成分的种类及含量产生不同的影响，有助于增加草果的香气风味。胡智慧等[6]研究表明，在熏干处理中，草果的化学成分的种类及含量比鲜果高。因此，人们对不同香辛料植物的油树脂进行提取，但尚未见直接以熏干处理后的草果为原料提取油树脂的研究报道。目前，针对油树脂的报道主要有DEVANI等[7]研究了超临界二氧化碳萃取洋葱油树脂的工艺优化。OLUSEGUM等[8]等采用加热回流法提取辣椒油树脂的工艺优化。吴桂苹等[9]采用超声波-微波辅助溶剂对胡椒鲜果油树脂进行工艺研究。因此，本实验以SDAT为原料，采用热回流法提取草果油树脂，并对其工艺进行响应面优化，以及对优化后的SDAT油树脂化合物成分进行分析鉴定，为开发SDAT附加值产品及深加工产业升级提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

熏干草果原料 购自云南怒江州，采用物料粉碎机将SDAT粉碎成不同粒径备用；无水甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、无水硫酸钠 均为分析纯。

YF-1000物料粉碎机 瑞安市永利制药机械有限公司；ME4002E电子天平 上海梅特勒－托利多仪器有限公司；SHZ-D真空抽滤装置 巩义予华仪器有限责任公司；RV10 D S25高效旋转蒸发仪 广州仪科科技有限公司；7890B-LECO气相色谱-飞行时间质谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 整粒熏干草果粉碎过筛，测得水分含量为11.7%，分别收集20、40、60、80目数的粉末样品待测。

1.2.2 油树脂提取工艺 参照包振伟等[10]方法，并稍作修改，精密称取20.00 g的SDAT粉末样品，置于圆底烧瓶中，进行热回流实验，然后进行过滤，旋转蒸发去除溶剂，直至不再有溶剂旋蒸出为止，然后冷却称其质量并计算得率。每组实验平行三次。以SDAT油树脂得率为考察指标，进行工艺优化。油树脂得率的计算公式：

油树脂得率（%）=SDAT油树脂质量（g）／SDAT粉末质量（g）×100

1.2.3 单因素实验 通过单因素实验，考察提取溶剂、提取温度、料液比，提取时间、细度五个因素对SDAT油树脂提取得率的影响。提取条件：保持提取温度65 ℃，料液比为1:10 g/mL、提取时间为3 h、细度为20目的条件不变，比较不同提取溶剂（无水甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚和正己烷）对熏干草果油树脂得率的影响。保持提取温度为无水甲醇、料液比为1:10 g/mL、提取时间为3 h、细度为20目的条件不变，比较不同提取温度（65、70、75和80 ℃）对熏干草果油树脂得率的影响。保持提取溶剂为无水甲醇、提取温度为75 ℃，提取时间为3 h、细度为20目的条件不变，比较不同料液比（1:10、1:15、1:20和1:25 g/mL）对熏干草果油树脂得率的影响。保持提取溶剂为无水甲醇、提取温度为75 ℃、料液比为1:20 g/mL，比较提取时间（3、5、7和9 h）对熏干草果油树脂得率的影响。保持提取溶剂为无水甲醇、提取温度为75 ℃、料液比为1:20 g/mL，提取时间7 h），比较细度（20、40、60和80目）对熏干草果油树脂得率的影响。根据以上单因素条件，进行熏干草果油树脂的提取。

1.2.4 响应面试验 根据单因素实验结果，利用Design Expert 8.0.5软件进行响应面试验设计，把SDAT油树脂的提取温度、料液比、提取时间作为响应面的三个实验因素，并且根据响应面的分析方法，优化三因素三水平提取草果油树脂的工艺，并综合考虑草果油树脂得率对草果油树脂提取工艺的影响，实验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 实验的因素水平Table 1 Factor and level of Box-Behnken experiment

1.3 SDAT油树脂风味物质分析鉴定

1.3.1 样品测定 将SDAT油树脂用二氯甲烷稀释50倍，经无水硫酸钠脱除水分，用0.45 μm孔径尼龙膜过滤于气相色谱专用小瓶中，用于GC-TOFMS分析。GC-TOF-MS分析条件：参照吴桂苹等[11]方法，并稍作修改。

1.3.2 GC分析条件 色谱柱为DB-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm，载气为氦气，流速为 1.0 mL/min；升温程序为50 ℃保持 0.2 min，以 4 ℃/min的速率升至90 ℃，以2 ℃/min 的速率升至160 ℃，20 ℃/min的速率升至220 ℃，保持 2 min；进样口温度为250 ℃；解析5 min；进样量1.0 μL，不分流，溶剂延迟360 s。

1.3.3 TOF-MS分析条件 EI离子源，电离能量：70 eV，离子源温度：200 ℃；传输线温度：250 ℃，质量数扫描范围：35～450 m/z，采集速率：10 spec/s，溶剂延迟300 s。通过Mainlib和Replib 谱库检索数据，采用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分比含量。

1.4 数据处理

所有数据用Excel，Origin8.6，SPSS23.0，Design Expert8.0.5软件处理，通过模型方程的决定系数R2及方差进行分析判定，统计显著性和回归系数显著性由F值来检测，P值取0.05、0.01两个不同水平。

2 结果与分析

2.1 单因素实验分析

2.1.1 不同溶剂对SDAT油树脂得率的影响 由图1可知，SDAT中的不同溶剂提取油树脂得率具有明显差异，其中，SDAT油树脂在不同提取溶剂中的提取得率依次为：无水甲醇（6.48%）＞无水乙醇（5.68%）＞丙酮（4.53%）＞乙酸乙酯（4.23%）＞石油醚（1.42%）＞正己烷（1.18%）。当提取溶剂为无水甲醇时，SDAT油树脂的提取得率最高，其次为无水乙醇。但是，提取溶剂为石油醚和正己烷时，油树脂的提取得率最低。因为溶剂的极性具有不同的强度，当溶剂的极性越强时，提取物中原料的溶解能力越强，从而导致SDAT油树脂的提取得率越高，并且极性较强的溶剂更易提取不挥发性成分。如树脂、脂肪、抗氧化剂、色素等[12-13]。因此，后续单因素实验均选取无水甲醇为提取溶剂。

图1 提取溶剂对草果油树脂得率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent of on the yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.2 提取温度对SDAT油树脂得率的影响 由图2可知，随着提取温度的升高，SDAT油树脂得率呈先增加后缓慢下降的趋势，当温度从65 ℃上升到70 ℃时，SDAT油树脂的提取得率从6.08%上升到7.25%，然后温度继续从75 ℃上升到80 ℃时，SDAT油树脂的提取得率从7.35%下降至7.28%。当提取温度为75 ℃时，SDAT油树脂的得率达到最高。这是因为随着温度的初步上升，溶剂流速和传质速度会随着温度升高而增大，导致SDAT粉中物质更易溶于无水甲醇中[14]，从而使SDAT油树脂得率增加。但是随着温度不断的升高后，油树脂得率呈下降趋势。这是因为随着温度持续升高，油树脂中部分成分由于温度较高，造成成分挥发损失[15]，导致SDAT油树脂得率下降。在实际的生产过程中，应该适当选取提取温度，因为当温度过高时，提取溶剂易沸腾，造成一定的安全隐患以及SDAT油树脂的提取得率下降，因此后续单因素实验的选取提取温度为75 ℃。

图2 温度对草果油树脂得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature ratio on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.3 料液比对草果油树脂得率的影响 由图3可知，当SDAT油树脂的提取溶剂过多或者不足时，都会给提取得率造成一定的影响。料液比对SDAT油树脂得率存在显著性影响（P＜0.05）。当料液比增加到1:20 g/mL时，SDAT油树脂的得率为9.57%，然后继续将料液比的体积至1:25 g/mL时，SDAT油树脂的得率下降至8.98%。结果显示，随着料液比的增加，草果的油树脂乳状液得率呈现先增加后下降的趋势，料液比为1:20 g/mL时，SDAT油树脂得率达到最高。由于料液比增大，固体基质到溶剂的传质速率就会越快[16]。溶剂过少，SDAT粉易在萃取过程中结块，溶剂无法穿透植物的细胞壁，导致油树脂得率降低，但是过量溶剂会造成溶剂油树脂扩散速度减慢，所以，当料液比过高时，主要传质应该限制在料液比范围内，从而减少溶剂使用率和实验成本[17]，因此后续单因素实验的选取料液比为1:20 （g/mL）。

图3 料液比对草果油树脂得率的影响Fig.3 Effects of solid to solvent ratio on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.4 提取时间对草果油树脂得率的影响 由图4结果显示可知，提取时间也是影响SDAT油树脂得率的重要因素之一，不同提取时间下草果油树脂的得率存在显著性差异（P＜0.05）。当提取时间从3～5 h时，SDAT油树脂的提取得率呈缓慢上升阶段，SDAT油树脂的提取得率从6.20%增加到7.05%。这可能由于SDAT粉表面的快速溶解的结果[18]。当在7 h时，SDAT油树脂的提取得率达到7.10%，此时得率最高。因为SDAT粉与溶剂充分接触，油树脂得率达到最高。当提取时间达到9 h时，其得率为6.40%，随着继续延长提取时间，SDAT油树脂的提取得率下降，这可能说明SDAT中的成分大多数已经被完全提取，因为提取时间越长，部分油树脂成分受到破坏，导致成分损失，造成SDAT油树脂得率提取得率呈现下降趋势。因此，选择最佳的提取时间是可以保证SDAT粉中的成分可以从植物基质中扩散出来，从而避免生物活性物质的降解[19]。所以，因此后续单因素实验的选取提取时间为7 h。

图4 提取时间对草果油树脂得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.5 细度对草果油树脂得率的影响 由图5可知，当草果粉的细度在20～40目时，得率最高仅有6.53%，这可能是因为由于草果粉没有充分粉碎，不利于有效物质提取，从而造成提取得率偏低。随着细度的增大，SDAT油树脂的得率不断增加。在SDAT粉细度达到80目时，SDAT油树脂得率达到7.55%，此时油树脂得率最大。原料细度对草果油树脂得率存在显著性差异（P＜0.05）。这可能因为原料的细度越大时，提取溶剂可以与提取原料的表面积更加充分的接触，植物的细胞壁破坏程度就越高，溶剂的穿透能力增大，有效物质更易提取，从而提高油树脂的得率。由于草果自身硬度较硬，无法粉碎更大粒径过100目筛。周雪敏等[19]的研究表明,胡椒油树脂在提取时，随着粒径的不断增大，其油树脂的得率也在不断增加，柳中等[20]研究表明，白胡椒油树脂依然是随着粒径的目数增加，其油树脂的得率也不断增加，这和本文的研究一致。所以，因此单因素实验的选取SDAT粉为80目。

图5 原料细度对草果油树脂得率的影响Fig.5 Effects of particle size on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.2 响应面试验结果

2.2.1 试验设计与结果 Box-Benhnken进行三因素三水平的试验设计，考察提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）对SDAT油树脂得率的影响，试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

对回归方程进行显著性检验分析，结果如表3所示。由表3可以看出，该模型极显著（P＜0.001），失拟项不显著（P=0.0787＞0.05），通过数据表明，回归方程的拟合度较好，模型实验的误差不显著。因此，可以将回归方程作为油树脂得率预测与分析的依据。得到的多元二次回归模型为：SDAT油树脂得率=9.43+0.77A-0.38B-0.11C-0.31AB-0.075AC+0.063BC-0.75A2-0.94B2-1.26C2，其 中 模 型 的A、B2、C2为 极显著(P＜0.0001)，B、A2、AB为显著(P＜0.05)。由提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个影响因素的F值可知，各单因素对草果油树脂得率影响的大小依次为：A＞B＞C；交互项对草果油树脂得率影响的大小依次为AB＞AC＞BC。模型中回归方程的相关系数R2＝0.9841，说明模型精确度高，可准确地对试验结果进行预测和分析，变异系数C.V.%=2.71，表明试验结果与真实值存在2.71%的偏差，模型可靠性较高。调整系数R2adj=0.9638，说明通过调整系数可以较好的解释96.38%的响应值变化，从而论证了回归方程的拟合度良好，精确度较高，实验误差不显著，重复性好的优点。

2.2.2 各因素间的相互作用 利用 Design Expert 绘制因子间的响应曲面图，对拟合的响应面形状进行分析，以及各因素之间的交互作用对SDAT油树脂得率的影响，其响应曲面见图6。

2.2.3 SDAT油树脂的响应面图分析 在响应面中，最高点就是等高线图中的最小椭圆的圆心，并且响应面图中的陡峭形状反应两两因素之间交互作用对响应值的变化情况。当响应面图的曲面越陡峭，两两因素的交互作用就越明显。相反，当响应面图的曲面越平缓，两两因素的交互作用就越不显著，等高线的形状就越趋于椭圆形，表明两个因素之间交互作用显著，反之则不显著[21]。由图6可知，各图均开口向下，凸形曲面，都存在极值。AB的交互作用对响应值影响较大，整个曲面陡峭程度较为明显，等高线的形状也接近椭圆，从而说明两两因素的交互作用较为显著。由图6a可知，提取温度对SDAT油树脂得率的影响大于料液比；由图6b可知，提取温度对SDAT油树脂得率的影响大于提取时间；由图6c可知，料液比对SDAT油树脂得率的影响大于提取时间。因此，各因素影响SDAT油树脂得率依次为A（提取温度）＞B（料液比）＞C（提取时间），其结果与方差分析结果相同，证明了该模型可靠性高。

图6 因素间交互作用对熏干草果油树脂得率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour of interaction effects of factors on smoked Amomum tsaoko

2.2.4 验证试验 通过Design-Expert 8.0.6 对回归方程求解，得出SDAT油树脂提取最佳条件：提取温度为76.11 ℃，料液比为21.11 g/mL，提取时间为6.73 h。在此条件下SDAT油树脂得率的理论值为9.57%。考虑实际操作可行性，将最佳工艺条件修正为：提取温度75 ℃，料液比为1:20 g/mL，提取时间7 h。经三次平行试验验证，SDAT油树脂平均得率为9.48%，结果与理论值相差不大，由此表明试验模型可靠，实验结果理想。

2.3 草果油树脂的GC-TOF-MS分析

对最佳工艺条件提取SDAT油树脂进行GCTOF-MS分析，其总离子流图如图7所示。经质谱工作站检索、人工谱图解析，并查对有关质谱图集资料[22]，鉴定SDAT草果油树脂中的化学成分，用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，结果如表4所示。

图7 草果油树脂挥发性风味物质GC-TOF-MS总离子流图Fig.7 The TIC of volatile flavor substances extracted from smok Amomum tsaoko by GC-TOF-MS

由表4可知，采用GC-TOF-MS对草果油树脂中的香气成分进行检测分析，共鉴定出58种香气成分。主要包括醇类（23种）、醛类（13种）、烯类（4种）、酮类（6种）、酯类（7种）、酚类（5种）。

由表4和图7可知，草果油树脂中，醇类占总化合物相对含量的31.59%、醛类占21.13%、烯类占1.23%、酮类占1.56%、酯类占2.38%、酚类占0.79%。其主要化合物成分相对含量最高的有1,8桉叶醇（9.28%）、香叶醇（8.4%）、反式柠檬醛（5.78%）、2-甲基-3-苯基丙醛（6.33%）、α-萜品醇（3.55%）等，相对含量较高的还有顺式柠檬醛（2.70%）、α-甲基肉桂醛（1.46%）、顺-2-癸醛（1.44%）、橙花醇乙酸酯（1.40%）等。其中大多数成分可在临床上用于治疗呼吸道疾病以及具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[23-24]。

表4 SDAT油树脂的化合物成分Table 4 The aroma components of smok Amomum tsaoko oleoresin

3 结论

本研究采用加热回流提取技术对SDAT油树脂进行提取，通过不同溶剂提取熏干草果油树脂，采用响应面试验对提取时间、料液比、提取温度三个重要变量进行了工艺优化，得到了SDAT油树脂的最佳提取条件为：提取温度为75 ℃，料液比为1:20（g/mL），提取时间为7 h，此时SDAT油树脂得率为9.48%。在最佳的工艺条件下，采用GC-TOF-MS对SDAT油树脂进行了成分测定。根据测定结果可知，共鉴定出58种化合物，相对总含量为58.68%。其中醇类化合物（31.59%）和醛类化合物（21.13%）的含量最高，占总化合物的52.72%。并且，在SDAT油树脂中的醇类、醛类、烯类、酮类、酯类、酚类的化合物之比分别为1:0.67:0.04:0.05:0.08:0.03。其中主要化合物相对含量最高的有1,8桉叶醇、香叶醇、反式柠檬醛、2-甲基-3-苯基丙醛、α-萜品醇，分别之比为1:0.91:0.62:0.68:0.38。提取的油树脂中1,8桉叶醇相对含量最高为9.28%。因此，根据SDAT油树脂的提取工艺及成分研究，可以为后期草果油树脂的营养成分以及生物活性提供理论依据，为开发草果附加值产品及深加工产业升级奠定理论基础。

续表 4