粪便HMGB1、AI-2和HBD2在新生儿坏死性小肠结肠炎中的临床意义及与肠道菌群的关系*

冉亚林，蒋秋容

1.重庆市大渡口区人民医院儿科，重庆 400084；2.陆军军医大学第一附属医院输血科，重庆 400038

新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)可较为迅速地进展为肠坏死、肠穿孔和多器官衰竭，甚至导致新生儿死亡[1]。现阶段临床诊断NEC的方法主要包括影像学和血液学指标，但因病情进展迅速，当影像学显示肠壁异常、门静脉积气、肠袢固定、气腹和腹腔积液时，NEC往往已经处于危重期。新生儿反复的静脉穿刺操作难度较大[2-3]，而粪便检测指标具有便捷、快速、对新生儿影响小和可多次检测的特点，寻找可以在疾病早期诊断NEC和判断病情的粪便指标，具有重要的临床意义。

高迁移率族蛋白B1(HMGB1)可被肠道中的炎性细胞和坏死的上皮细胞表达并分泌，从而在粪便中被检测到，最新研究发现，HMGB1水平在NEC患儿粪便中升高[4]。自诱导分子-2(AI-2)具有在细菌之间传递信息的作用，并参与肠组织的炎性反应[5]。人β-防御素2(HBD2)主要由与外界接触的黏膜细胞表达，包括肠黏膜细胞，其具有杀伤细菌和免疫趋化的作用，研究已经发现，其在NEC患儿体内异常表达[6]，但是其在NEC中的临床意义尚不清楚。因此，本研究主要分析粪便HMGB1、AI-2和HBD2在NEC中的临床意义，以及它们与肠道菌群间的关系，为临床更好地诊断NEC提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2019年9月重庆市大渡口区人民医院收治的105例NEC患儿作为NEC组，以及同期出生的50例健康新生儿作为对照组。2组患儿的一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究符合赫尔辛基宣言，获得重庆市大渡口区人民医院医学伦理委员会批准，受试新生儿家长知情同意并签署知情同意书。

表1 2组新生儿一般资料比较

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)日龄2～10 d；(2)经组织学、影像学等检查，符合NEC的诊断标准[7]；(3)患儿临床资料齐全。排除标准：(1)合并获得性免疫缺陷综合征、血液性疾病、免疫疾病等患儿；(2)合并恶性肿瘤等患儿。

1.3方法

1.3.1粪便标本的采集及检测 采集健康新生儿出生2～10 d的粪便标本，以及NEC患儿确诊入院时(急性期)和病情好转且母乳喂养3 d后(恢复期)的粪便标本。采用酶联免疫吸附试验(试剂盒由上海研谨生物科技有限公司提供)检测粪便中HMGB1和HBD2水平，根据试剂盒说明书的方法，分别加入抗体的显色剂，终止显色后使用酶标仪(美国Thermo公司)检测450 nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算HMGB1和HBD2水平(每克粪便的含量)。采用化学发光法检测粪便标本的AI-2水平，将40 mg粪便标本与1.5 mL的AI-2专业培养基哈维弧菌BB 170(ATCC®14126，美国ATCC公司)混合，在4 ℃下以5 000 r/min离心10 min，收集上清液，然后接种到培养基中孵育过夜。然后使用酶标仪检测粪便标本的生物发光值，以1 μmol/L的AI-2溶液(美国Sigma公司)作为对照，标本检测值的百分比数值即为AI-2水平。

1.3.2NEC患儿病情及肠道菌群紊乱程度评估 使用改良Bell-NEC分期标准[8]，根据患儿全身症状、胃肠道症状、影像学检查结果及治疗情况，对患儿的病情和预后进行分级评估，Ⅰ级和Ⅱa为轻度NEC，Ⅱb和Ⅲ级为重度NEC。所有患儿在确诊当日采集粪便标本，并立即进行检测，根据《肠道菌群粪便涂片检查图谱》[9]将肠道菌群紊乱程度分为4个等级：(1)基本正常，粪便标本细菌总数处于正常值范围,革兰阳性菌数大于革兰阴性菌数,革兰阳性或阴性球菌少见;(2)Ⅰ度失调，粪便标本细菌总数略低于正常值,革兰阳性菌数小于革兰阴性菌数,革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌增多;(3)Ⅱ度失调，粪便标本细菌总数明显低于正常值,革兰阴性杆菌总数增多,革兰阳性球菌数目较多,有少量酵母样菌;(4)Ⅲ度失调，粪便标本细菌总数极少,未见或很少见革兰阳性或阴性杆菌,酵母样菌比例较多。分级越高，肠道菌群紊乱程度越严重。

2 结 果

2.1对照组及急性期不同病情严重程度NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较 根据Bell-NEC分期，NEC患儿分为轻度NEC组54例，重度NEC组患儿51例。对照组、轻度NEC组、重度NEC组HMGB1、AI-2和HBD2水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，NEC组粪便HMGB1水平升高，AI-2和HBD2水平降低，且重度NEC组HMGB1水平高于轻度NEC组，AI-2和HBD2水平低于轻度NEC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 对照组和不同病情严重程度急性期NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较

2.2急性期NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平与NEC病情严重程度的相关性 Spearman相关分析结果显示，粪便HMGB1水平与NEC病情严重程度呈正相关(r=0.412，P<0.05)，AI-2和HBD2水平与NEC病情严重程度均呈负相关(r=-0.405、-0.381，P<0.05)。

2.3对照组及不同NEC时期患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较 对照组、急性期、恢复期HMGB1、AI-2和HBD2水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，急性期和恢复期HMGB1水平升高，且恢复期低于急性期(P<0.05)；急性期AI-2水平低于对照组及恢复期，且恢复期高于对照组(P<0.05)；急性期和恢复期HBD2水平低于对照组，且恢复期高于急性期(P<0.05)，见表3。

表3 对照组及不同NEC分期患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较

2.4对照组及不同肠道菌群紊乱程度急性期NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较 对照组及不同肠道菌群紊乱程度的NEC患儿急性期粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组粪便HMGB1水平<Ⅰ度失调组<Ⅱ度失调组<Ⅲ度失调组(P<0.05)，而对照组AI-2和HBD2水平>Ⅰ度失调组>Ⅱ度失调组>Ⅲ度失调组(P<0.05)，见表4。

表4 对照组及不同肠道菌群紊乱程度NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平比较

2.5急性期NEC患儿粪便HMGB1、AI-2和HBD2水平与肠道菌群紊乱程度的相关性 Spearman相关分析结果显示，HMGB1水平与肠道菌群紊乱程度呈正相关(r=0.368，P<0.05)，AI-2和HBD2水平与肠道菌群紊乱程度均呈负相关(r=-0.432、-0.406，P<0.05)。

3 讨 论

NEC的临床表现主要为腹胀、呕吐和便血，但目前尚不清楚其确切病因，且发病率和病死率始终较高。据报道，在新生儿重症监护室，NEC的发病率为2%～5%，其中极低出生体质量儿发病率为4.5%～8.7%，病死率为20%～30%，超低出生体质量儿病死率则高达30.0%～50.9%[10-12]。临床研究发现，NEC的危险因素包括早产和低出生体质量状态、肠和免疫系统的发育不成熟，以及配方奶喂养等[13]。此外，最新研究结果显示，肠道菌群失调也与NEC密切相关[14]，益生菌的破坏和潜在致病菌的过度生长是早产儿NEC发生的重要原因[15-16]。但肠道菌群培养需要的时间较长，无法对患儿的早期治疗提供指导作用，而二代测序技术又较为昂贵，应用有限。为此，本研究旨在寻找可有效反映NEC病情和判断肠道菌群失调情况的简便、经济、快捷的临床检测指标。

HMGB1是一种从受损细胞中释放的DNA结合蛋白，具有类似炎症细胞因子的特性，并且可以由巨噬细胞分泌，也可以由受损的肠黏膜上皮细胞分泌[17]。HMGB1不但可反映炎症的严重程度，还可通过激活Toll样受体4相关通路削弱肠道上皮细胞的迁移和黏附，阻碍组织修复[18]，而这会进一步引起肠黏膜屏障受损，导致肠道菌群入侵和异常繁殖[19]。本研究结果显示，NEC患儿粪便中HMGB1水平明显升高(P>0.05)，且与病情严重程度呈正相关(r=0.412，P<0.05)，而随着疾病的控制，HMGB1水平则逐渐降低(P>0.05)。本研究结果还显示，HMGB1与肠道菌群紊乱程度有关(r=0.368，P<0.05)。罗若谷等[20]的研究显示，粪便中HMGB1水平升高，且可作为早期诊断NEC的指标，但该研究未分析其与NEC病情的关系。在成人溃疡性结肠炎中，粪便中HMGB1水平升高预示着病情加重[21]，这提示在NEC患儿中，粪便中HMGB1水平升高可能反映肠道上皮组织出现严重的炎性反应，肠黏膜组织受损且组织修复能力受阻，并且可反映肠道菌群紊乱程度，而随着病情的改善，肠道细胞损伤降低，且炎性反应得到缓解，从而使HMGB1水平降低。因此，HMGB1水平可作为早期判断NEC患儿病情和肠道菌群紊乱程度的指标，并且其水平降低可能提示病情好转。

肠道菌群紊乱与机体的免疫炎性反应有关，近年来的研究结果显示其参与了NEC的发病进程，拟杆菌门/属细菌水平的失调是诱发NEC的高危因素，并且肠道菌群紊乱程度也与NEC病情具有相关性[15]。HBD2由肠道细胞分泌，不但可以调控免疫反应，还具有抑制细菌过度繁殖和调控菌群平衡作用[22]。AI-2是革兰阴性或者阳性菌群之间交流的信号，当AI-2水平降低时，细菌过度繁殖，有研究结果显示粪便AI-2作为肠道菌群标志物的应用，但其在NEC中的临床意义仍不清楚[23]。本研究结果显示，急性期NEC患儿粪便中HBD2和AI-2水平明显降低(P<0.05)，且与病情严重程度呈负相关(r=-0.405、-0.381，P<0.05)，而随着疾病的控制，HBD2和AI-2水平逐渐升高，其中AI-2水平高于健康新生儿(P<0.05)。此外，本研究结果还显示，HBD2和AI-2水平降低与NEC患儿肠道菌群失衡严重程度有关(r=-0.432、-0.406，P<0.05。实验证实，结肠炎模型小鼠结肠黏膜中的HBD2水平降低，而病情得到缓解后肠黏膜中表达的HBD2水平明显升高[24]。王雨等[25]的研究结果显示，当肠黏膜细胞受损后，HBD2水平降低，会引起肠道菌群异常。最新研究结果也显示，在NEC患儿恢复期，粪便中AI-2水平会明显升高，这期间虽然肠道菌群可能仍旧异常，但病情正在好转[26]。这提示肠黏膜损伤导致的HBD2和AI-2表达水平降低，会促进肠黏膜细菌的过度繁殖，进而参与NEC的进展，而菌群过度繁殖也会进一步损伤肠黏膜。在NEC恢复过程中，肠黏膜修复促进HBD2的表达，AI-2水平升高也会进一步调控菌群平衡。因此，粪便中HBD2和AI-2水平可作为反映NEC病情和肠道菌群紊乱的指标，并且其水平升高提示肠黏膜的修复和肠道菌群平衡趋于正常，预示着NEC病情的好转。通过及时检测粪便HMGB1、HBD2和AI-2水平，不但有助于在早期评估NEC病情，还可判断疾病的改善情况，具有便捷、经济的优点。然而，关于HMGB1、HBD2和AI-2在NEC病情和预后中的诊断与临床价值，仍需要扩大样本量进行研究，其参与NEC的机制仍需要深入探究。

综上所述，粪便HMGB1、HBD2和AI-2水平与NEC的病情严重程度有关，且可以反映肠道菌群紊乱情况，而HMGB1水平的降低，及HBD2、AI-2水平的升高预示着肠黏膜组织的修复和菌群过度繁殖状况得到抑制。