FRD联合HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈上皮内瘤变的诊断意义*

潘智茵，王 刚，林铁成，谢 咏

1.广东省佛山市第一人民医院肿瘤妇科，广东佛山 528000；2.四川省妇幼保健院妇产科，四川成都 610032

宫颈癌作为一种女性常见的恶性肿瘤，每年新患病人数约50万，4/5的新发病例位于发展中国家。宫颈癌新发数量占肿瘤总的新发数量的5%，其发病率位于全世界女性所患恶性肿瘤的第2位[1]。每年因宫颈癌死亡的女性约有26万人之多，其中中、低居民收入的国家病死率最高，我国女性患宫颈癌的发病率和病死率也在逐年上升，宫颈癌正威胁着我国女性的身体健康[2]。宫颈癌的癌前病变为宫颈上皮内瘤变(CIN)，对CIN的早期诊断和治疗有利于减低宫颈癌的发病率和病死率。叶酸受体介导的宫颈特殊染色法(FRD)是一种上皮组织染色技术，该方法具有简单、便捷、无创、价格低的特点，可以对患者快速分流，且易于被患者接受。但是由于其特异性较差，容易出现假阳性，所以寻找一些生物标志物具有重要意义。近年来有研究显示有诸多分子生物学检查也可应用于CIN和早期宫颈癌的诊断[3-4]。本研究分析FRD联合分子生物学指标[高危人乳头状瘤病毒(HR-HPV)DNA、人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA]检测对CIN的诊断意义，为临床治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究采取前瞻性研究，以2018年5月至2020年4月在佛山市第一人民医院进行诊治的200例CIN患者作为观察组，另选取同期100例健康妇女作为对照组。患者纳入标准：(1)所有患者均符合2014年世界卫生组织发布的《CIN Ⅱ～Ⅲ与AIS治疗指南》中CIN Ⅱ～Ⅲ级的诊断标准[5]；(2)患者性生活史>1年，无急性炎症及其他生殖系统禁忌证；(3)患者的卡式评分均在60分以上。排除标准：(1)排除精神异常患者；(2)无法正常沟通患者；(3)哺乳期或妊娠期患者；(4)其他生殖系统疾病患者。观察组年龄40～49岁、平均(45.57±2.09)岁，平均体质量指数(24.25±2.18)kg/m2；对照组年龄41～50岁、平均(44.64±2.43)岁，平均体质量指数(23.64±2.54)kg/m2。2组研究对象一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均签署知情同意书，本研究经佛山市第一人民医院医学伦理委员会论证通过。

1.2方法

1.2.1FRD 对所有受试者取膀胱截石位，使用一次性扩阴器暴露宫颈。宫颈染色：用大棉签蘸取FRD上皮组织特殊染色液(陕西高源医疗器械有限公司生产)，然后在宫颈表面用力涂抹5圈，再在宫颈外口按压10 s，取出棉签并迅速观察颜色。宫颈管染色：使用专用小棉签蘸取适量染色液，然后将小棉签插入宫颈管，深度约为1.5～3.0 cm，并紧贴宫颈管内壁旋转5圈，取出棉签并迅速观察颜色。以棉签颜色最深的部位作为判断依据，并采取双人判读模式。判断标准：(1)阳性，棉签颜色为蓝色、蓝黑色、蓝绿色、黑色；(2)阴性，棉签颜色为棕色、绿色、淡黄色。

1.2.2分子生物学诊断 (1)HR-HPV DNA测检：在受试者月经干净且未有性生活3 d后，使用专用采样器收集宫颈分泌物，对分泌物中细胞的DNA进行提取，用PCR-反向点杂交技术检测HR-HPV DNA，所有操作过程严格按照HPV基因检测设备(深圳市亚能生物科技有限公司)说明书手动操作。(2)HPV E6/E7 mRNA检测：用专用刷收集宫颈表面标本，将所获标本置入保存管中。采用中美合资Cotia生物技术有限公司生产的Quanti Virus TM诊断试剂盒和Quanti Virus TM冷光仪器，以支链DNA技术检测HPV E6/E7 mRNA，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3观察指标 观察并比较2组受试者及不同病理分级CIN患者的FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7检测结果，分析CIN的诊断、病理分级与FRD阳性检出率、分子生物学指标的相关性，分析FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA单独和联合检测对CIN的诊断效能。

2 结 果

2.12组受试者FRD诊断结果比较 FRD检测CIN的假阳性率为3.00%，假阴性率为8.00%，2组FRD诊断CIN的准确率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 2组受试者FRD诊断结果比较

2.2不同病理分级CIN患者的FRD诊断结果比较 不同病理分级CIN患者FRD检测的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较，CIN Ⅱ级、Ⅲ级患者FRD检测的阳性率均高于CIN Ⅰ级(P<0.05)，CIN Ⅱ级、Ⅲ级阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同病理分级CIN患者的FRD诊断结果比较

2.32组受试者的分子生物学指标检测结果比较 HR-HPV DNA检测诊断CIN的假阳性率为1.00%，假阴性率为17.50%；HPV E6/E7 mRNA检测诊断CIN的假阳性率为1.00%，假阴性率为22.50%。2组HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测诊断CIN的准确率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 2组受试者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测结果比较

2.4不同病理分级CIN患者分子生物学指标检测结果比较 不同病理分级CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)；两两比较，CIN Ⅱ级、Ⅲ级患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率均高于CIN Ⅰ级(P<0.05)，CIN Ⅱ级、Ⅲ级的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同病理分级CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测结果比较

2.5CIN诊断、病理分级与FRD、分子生物学指标检测阳性率的相关性 经Spearman相关分析显示，CIN诊断、病理分级与FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率均呈正相关(r>0，P<0.05)，见表5。

表5 CIN诊断、病理分级与FRD、分子生物学指标的相关性

2.6FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA单独和联合检测对CIN的诊断效能 FRD、HR-HPV DNA、HPVE6/E7mRNA联合检测诊断CIN的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度均明显高于单独检测诊断的AUC、灵敏度和特异度(P<0.05)，见表6、图1。

表6 FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA单独和联合检测对CIN的诊断效能

项目特异度(%)阳性预测值(%)阴性预测值(%)SEAUC(95%CI)PFRD52.0076.3553.6111.2310.775(0.520～0.872)0.017HR-HPV DNA58.0078.7956.861.0270.792(0.762～0.870)<0.001HPV E6/E7 mRNA55.0076.1949.553.2220.692(0.607～0.816)<0.0013项联合95.0097.4490.480.0270.978(0.762～0.869)<0.001

图1 FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA单独和联合检测诊断CIN的ROC曲线

3 讨 论

宫颈癌前病变无明显体征，一般认为宫颈癌前病变进展至宫颈癌需要经历增生、上皮内瘤变、原位癌、早期浸润癌等阶段[6]。为了能够有效减少宫颈癌的发生，需要及时地发现宫颈癌早期病变并给予及时的治疗[7]。在宫颈癌筛查方面，随着科学技术的不断发展，存在着多种对CIN的检测方法，常见的有液基薄层细胞学检查、HR-HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA等检查。在长期的应用过程中，上述检测方法的特异度或灵敏度都有所降低[8]。而FRD检测作为一种新型宫颈癌前病变的筛查方法，其检测较为迅速,耗材成本较低，操作简便并且属于无创检测,患者依从性高，易于推广[9]。

本研究中，FRD检测CIN的假阳性率为3.00%，假阴性率为8.00%，观察组与对照组诊断准确率差异无统计学意义(P>0.05)；在观察组中，随着CIN患者的病理分级等级升高，FRD检测的阳性率也升高，该结果与现有研究结果一致[10]。用于FRD检测的上皮组织特殊染色液是一种活细胞染色剂，由叶酸复合物、亚甲蓝等组成，而叶酸受体在正常细胞中较少表达，却在肿瘤细胞中高表达，且肿瘤细胞与亚甲蓝有高度亲和性[11]，故可用于CIN的检测。但FRD检测ICN有假阳性，其对CIN的诊断有一定的局限性。FRD对CIN的检测极易受到分泌物和血液的影响，在临床上单纯通过FRD诊断CIN，容易造成假阳性的产生[12]。所以在临床上通常还对患者的生物标志物进行分析，这对于患者的诊断具有重要价值。由于HPV检测是一种基于宫颈癌病因学的检测手段，客观性强，可重复性高，因此，虽然HPV检测技术出现较晚，但已逐渐成为宫颈癌前病变的主要初期筛查手段之一[13-14]。本研究结果显示，不同病理分级CIN患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较显示，CIN Ⅱ级、Ⅲ级患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率均高于CIN Ⅰ级(P<0.05)，CIN Ⅱ级、Ⅲ级的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，说明随着CIN患者的病理分级等级升高，其HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率也明显提升。笔者分析认为，在以往的临床研究中发现，HPV高危感染处是宫颈癌的主要病变部位，90%以上的宫颈癌患者病变区域HPV检测呈阳性，特别是HR-HPV感染与宫颈癌进展存在密切关系[15]。

FRD检测属于形态学检查的一种，而形态学改变多出现在HPV感染后，且多种因素均能影响形态学特点，进而影响FRD检测的灵敏度。HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测可以反映机体是否存在HPV感染和病毒癌基因，而对是否存形态学改变不能确定，不能揭示复发及进展情况[16-17]。单独使用FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测对CIN均具有一定诊断效能，相关性分析结果显示，CIN的诊断、病理分级与FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测阳性率均呈正相关(r>0，P<0.05)。本研究还发现，FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA联合检测的AUC、灵敏度和特异度均高于单独检测诊断的AUC、灵敏度和特异度(P<0.05)，说明联合检测可提高对CIN的诊断效能。但本研究样本量有限，对于CIN患者的临床诊断具有一定的局限性，有待在今后的研究中改善。

综上所述，FRD、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA联合检测对CIN具有较高的诊断效能，值得临床推广。