遗传性视神经病变患者临床表型及基因检测多态性分析—单中心队列研究△

冯超逸 孙平 孙兴怀,2 陈倩 田国红,2

(1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031；2.国家卫健委及中国医学科学院近视眼重点实验室(复旦大学) 上海市视觉损害与重建重点实验室(复旦大学) 上海 200031)

遗传性视神经病变(hereditary optic neuropathy，HON)是儿童及青少年中导致视力障碍的主要眼疾之一。由于年龄、遗传背景分布各异，临床因急、慢性视力下降或“视神经萎缩”来诊的患者中，HON的疾病分类不尽相同。临床常见的是Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)和国外报道较多的常染色体显性遗传性视神经病变(autosomal dominant hereditary optic atrophy，ADOA)，以及伴发神经系统其他损害的叠加综合征[1-3]。以往我们的研究[4]显示，国内HON患者中最常见类型仍为LHON，其次为ADOA。随着现代科技的发展，基因检测手段得以不断更新，使得临床疾病的诊断精准化。一些与线粒体疾病相关的核基因突变越来越多地被发现并报道，以往“不明原因”的视神经萎缩患者大多得以精准诊断。很多HON伴有复杂的神经系统或多系统损害或综合征，视神经萎缩是其共同特征。本研究通过对近8年来本院神经眼科中心拟诊HON的一组患者进行完善的二代测序及家系验证，总结分析国人HON常见病因及临床特征，以及少见基因突变的多态性。

1 资料与方法

1.1 资料 入组2013年5月～2021年10月就诊于本院神经眼科或转诊评估的视神经萎缩患者。该研究经医院伦理委员会批准(KJ2011-04)。所有患者均签署纸质知情同意书。

纳入标准：①视力下降、视野缺损、色觉减退；②检眼镜(眼底镜)下观察到视神经萎缩；③颅脑/眼眶磁共振成像或CT扫描未见颅内占位、脑积水、炎症及静脉系统狭窄；④常规血液学检查及感染组套未见异常。

排除标准：①明确与急性视力下降相关的颅脑/眼眶外伤史；②血清学/影像学证实视神经萎缩由视神经炎导致，激素/免疫治疗后视力有所好转；③感染性疾病，如结核、梅毒、艾滋病等；④临床资料欠完整。

1.2 人口学资料及眼科检查 收集患者年龄、性别、出生史、发育史、系统性疾病史、烟酒及用药史。眼科检查包括检眼镜下视盘及视网膜形态观察及裂隙灯检查。眼科辅助检查包括最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)、眼底照相、视野检查、光学相干层析成像(optical coherence tomography，OCT)、眼部高频B超等。

1.3 视力分级 BCVA测量后分为1～5级：0.8或以上；0.4～0.7；0.1～0.3；＞数指(CF) ～＜0.1；无光感(NLP)～CF。

1.4 视野检查 静态Humphrey/Octopus视野；视力＜0.1的患者行Goldmann视野检查。结果分为6种类型：正常、中心暗点/连生理盲点暗点、旁中心暗点、象限缺损、视敏度下降、弥漫性缺损。

1.5 Cirrus OCT检查 使用Cirrus OCT 5000 (Carl Zeiss Meditec，德国)对能配合的患者进行视盘周围视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度及黄斑区神经节细胞-内丛状层(ganglion cell and inner plexiform layer，GCIPL) 厚度测量。使用视盘ONH 200 × 200 程序覆盖视盘周围直径3.4 mm范围。GCIPL扫描使用512 × 128 Cirrus 程序覆盖黄斑6 mm×6 mm范围。使用分析软件测量RNFL和GCIPL厚度，信号强度≥7 为有效测量。

1.6 基因二代测序 取患者及其家属外周静脉血各2 mL(EDTA抗凝)。使用血液基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)提取样本DNA，使用 Nanodrop 2000对DNA进行质检，质检合格后进行下一步实验。

1.6.1 高通量测序 使用标准文库构建试剂盒(迈基诺自主研发)进行基因组文库构建。对纯化产物进行链接介导的聚合酶链反应(ligation-mediated polymerase chain reaction，LM-PCR)，扩增纯化后得到DNA文库，使用 Nanodrop 2000和琼脂糖凝胶电泳对文库进行质量检测。采用目标序列捕获探针(MyGenostics，GenCap)对194个已知的神经眼科疾病相关基因外显子及其上下游50 bp区域进行捕获。借助Illumina NovaSeq 6000对捕获的外显子区域进行高通量测序。

1.6.2 数据分析 利用BWA软件将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上[5]。结合疾病遗传模式和患者临床表征进行综合分析，筛选出可疑候选变异。

1.6.3 Sanger测序验证 利用PCR和Sanger测序验证经分析筛选后得到的候选变异位点。利用Primer 3.0在线软件设计PCR引物。PCR扩增产物使用3130XL测序仪进行毛细管电泳测序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上进行分析。再在家系成员中进行共分离验证。

1.7 统计学处理 人口学数据使用均数及百分比。BCVA、视野采用分级指标并计算百分比。采用IBM SPSS 统计软件 version 26.0 (IBM Corp，Armonk，美国)。

2 结果

2.1 临床特征 537例拟诊HON患者中，遗传性视网膜病变88例(16.4%)。入组449例拟诊HON患者中，除外13例确诊为视神经炎、13例为药物及中毒(甲醇、甲醛、四氯化碳等)诱发、1例梅毒感染引起、42例临床资料不全，共计375例患者纳入统计学分析。获得基因检测阳性结果249例(66.4%)，其中男性196例、女性53例，男/女比为3.7∶1。二代测序基因结果显示：LHON 169例(67.9%)、ADOA 45例(18.1%)、Wolfram综合征(Wolfram syndrome，WFS)16例(6.4%)，基因型及表型具体见表1。确诊时患者平均年龄为(21.15±13.06)岁(95%CI：19.51～22.79)，中位数年龄为18岁(P25=11，P75=30)，呈偏态分布。ADOA、LHON、WFS 3 组间确诊年龄差异无统计学意义(P=0.193)。

表1 HON表型及基因型人口学数据

男性196例(78.7%)、女性53例(21.3%)。男女性别比，ADOA和LHON间差异无统计学意义(P=0.285)，ADOA与WFS间差异有统计学意义(P=0.012)，LHON与WFS间差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 基因型及临床表现 LHON患者中3个原发位点11778、14486及3460突变的比例分别为60.9%、9.5%及5.9%。男女比为5.5∶1，年龄分布见图1A。患者初始视力分级见图1B。发病时平均视力为0.08±0.12。完成视野检查128眼，视野缺损类型中，中心暗点/旁中心暗点72眼(56.3%)，弥漫性缺损51眼(39.8%)。基因检测环DNA点突变位点分布见表2。

表2 本研究LHON基因突变位点分布

图1 LHON患者年龄分布及视力分级 A.年龄分布；B.视力分级。

ADOA患者中OPA1突变占96.6%，2例患者的突变基因为OPA3。OPA1患者男女比为3.3∶1，年龄分布见图2A。患者初始视力分级见图2B。发病时平均视力为0.30±0.23。视野缺损类型中，中心暗点/旁中心暗点28眼(63.6%)，弥漫性缺损5眼(11.4%)。

图2 ADOA患者年龄分布及视力分级 A.年龄分布；B.视力分级。

WFS患者共计16例，其中WFS1突变的WFSⅠ型14例、CISD2突变的WFS Ⅱ型2例，男女比为1∶1.3，中位数年龄为19.5岁。患者发病时平均视力为0.24±0.18。视野缺损类型中，弥漫性缺损10眼(58.8%)，视敏度下降7眼(41.2%)。

发病时平均视力，LHON与ADOA间差异有统计学意义(P＜0.001)，LHON与WFS间差异有统计学意义(P＜0.001)，ADOA与WFS间差异无统计学意义(P=0.260)。视野缺损类型，ADOA与LHON、WFS间差异均无统计学意义(P值均＞0.05)，LHON与WFS间差异有统计学意义(P＜0.001)。

3 讨论

HON的典型特征是乳斑束区域神经纤维层和神经节细胞层的不可逆变薄。诊断时需要排除隐匿的视网膜变性类疾病，因其同样可表现为视盘颜色苍白。常见的遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及线粒体遗传。它具有临床异质性，同一致病基因在不同家庭成员之间可能临床表现不同，线粒体基因的突变频率也会导致表型的变化。不同的基因型也有可能导致相似或相同的表型。

LHON作为通常具有急性病程的视神经病变，被认为是中国人主要的HON[18-19]。近年来随着基因检测手段的提高以及神经眼科医师对视神经萎缩疾病认识的深入，除LHON以外的其他类型线粒体疾病，尤其是核基因相关的ADOA、WFS等逐渐被认识[20]。本研究中甚至有很多极为罕见的基因突变导致的特殊视神经病变。

LHON是中国人重要的导致青少年致盲的遗传性疾病。我们的队列研究显示：发病年龄高峰在10～20岁；平均视力差，中位视力集中在＞CF～＜0.1。早期眼底视盘毛细血管扩张充血的假性水肿表现极具诊断价值(图3)，亚急性期与慢性期虽然也有其特征性表现，但与其他疾病导致的视神经萎缩不易鉴别(图4)。乳斑束在不同时期均呈现明显萎缩、变薄。视野表现与以往报道的中心视野受累类似(图5)。随着OCT技术广泛用于神经眼科，我们发现急性期(甚至超急性期)患者视盘周围RNFL并不会变薄，相反是假性水肿导致的增厚；但黄斑GCIPL出现变薄的趋势。这种趋势在亚急性期与慢性期尤为明显；晚期不可避免地出现RNFL及GCIPL明显变薄的特征。OCT的此种表现可用于与急性视神经炎的鉴别诊断：视神经炎是以视神经轴索损害为主的疾病，急性期(1个月内)不会出现黄斑GCIPL的丢失；相反，LHON为视网膜神经节细胞为主的线粒体能量代谢疾病，GCIPL在急性期即明显丢失(图6)。

图3 LHON患者眼底照片及荧光素眼底血管造影 A.双眼发病患者早期眼底视盘毛细血管扩张充血。B.荧光素眼底血管造影显示无荧光渗漏，为假性水肿。C.右眼发病患者眼底示右眼视盘鼻侧充血、色红，颞侧苍白，乳斑束萎缩；左眼视盘亦表现为充血、色红。D.双眼先后发病患者右眼视盘苍白、萎缩(晚期)；左眼视盘边界欠清、假性水肿(急性期)。

图4 LHON患者不同时期眼底形态 A.急性期双侧视盘毛细血管扩张充血、色红，假性水肿；B.亚急性期视盘充血逐渐消退，视乳头黄斑束萎缩；C.晚期视盘颞侧苍白萎缩，神经纤维层弥漫性变薄。

图5 LHON患者视野损害类型 A.中心暗点；B和C.连生理盲点中心暗点；D.中心视野缺损；E.双眼上方弓形视野缺损；F.中心暗点(Goldmann视野检查)。A～E为Humphrey视野检查。

图6 LHON患者不同时期OCT表现 A.急性期双侧视盘RNFL基本正常(或轻度增厚)，但黄斑GCIPL开始变薄(左眼为先发病眼)；B.亚急性期视盘RNFL未见明显变薄，但黄斑GCIPL明显丢失变薄；C.晚期视盘RNFL及黄斑GCIPL显著变薄。

该队列研究中ADOA的发病高峰年龄为5～10岁，较LHON明显降低。ADOA单眼发病的患者比例远远高于LHON。患眼视力水平集中在0.1～0.3。视野表现多为中心暗点或旁中心暗点。表明ADOA发病平均年龄更小，常常无主观急性视力下降的主诉，而是学前体检时发现来诊。该队列中还包括2例罕见的OPA3突变。ADOA的家族遗传史相比LHON的单纯母系遗传更加复杂，且家族中发病患者视力水平相差甚远。我们的经验是单眼/双眼不明原因的视神经萎缩患儿，排除颅内明确占位性病变后，建议行基因检测明确是否有HON的基因突变(图7)。

图7 OPA1患儿眼底检查 A.双眼视盘弥漫性苍白萎缩，眼位偏斜(斜视)；B.Humphrey视野检查示双眼颞侧偏盲；C.CT检查示双眼视盘颞侧RNFL对称性变薄，黄斑GCC弥漫性变薄。

该队列显示大龄/老龄(年龄＞45岁)发病的LHON/ADOA患者绝大多数为酗酒、吸烟、抗结核药物导致，符合线粒体疾病发病与肝脏能量代谢衰竭密切相关；也证实线粒体疾病的发病除了先天基因异常外，外界环境也是促发病变的重要因素。有趣的是，该队列中很多患者甚至携带了2个或以上的线粒体点突变位点，或者OPA1合并线粒体点突变位点。这类患者发病可能是原发突变位点起主要作用，继发位点加重了线粒体能量代谢异常的损害。

WFS作为少见的疾病在该队列中亦有特殊表现。明确诊断WFS的16例患者，除2例CISD2基因突变外，均为WFS1常染色体隐性遗传，且家系验证显示父母均为杂合携带者。由于WFS1基因编码的蛋白功能为调控线粒体内质网钙离子通道蛋白，其突变间接导致线粒体功能异常，因此出现与线粒体疾病类似的视神经萎缩[23-24]。临床中如单纯检测线粒体相关基因则容易漏诊。

本研究中发现文献报道过的可导致视神经萎缩的神经系统疾病包括视神经萎缩5型(DNM1L)[25]、视神经萎缩9型(ACO2)[26-27]、脊髓小脑共济失调28型(AFG3L2)[28-29]、遗传性痉挛性截瘫(SPG7)[29]、Leigh综合征(NDUFS2)[30-32]、Crouzon综合征(FGFR2)[33-34]、Bardet-Biedl 综合征(BBS10)[35]、多小脑回视神经萎缩(TUBA8)[36]、身材矮小、视神经萎缩和Pelger-Huet异常(NBAS)[37]、Warburg micro综合征3型(RAB18)[38-39]、线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作MELAS(m.13513G＞A)[40]、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维MERRF(m.8344A＞G)[41]等罕见突变。

综上所述，儿童及青少年不明原因的视力下降及视神经萎缩很多是由于遗传性疾病导致的，有针对性地进行基因检测有助于疾病的精准诊断以及为后续的基因治疗奠定基础。

志谢：感谢复旦大学附属眼耳鼻喉科医院生物样本库及迈基诺基因公司对本研究的大力支持。