基于贝尔曼漏斗法的土壤线虫最优分离时长探究

普国庆，罗 丹，赵成法，谭 坤，刘硕然，肖 文，李延鹏*

（1.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003；2.云南省富源县第一中学，云南曲靖 655500；3.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003）

土壤是生态系统物质能量循环的重要载体，是生物圈中最为重要的生态系统之一，也是绿色植物生长的基础〔1〕。土壤生态系统中存在着世界上最大的动物类群——土壤动物，土壤线虫是土壤动物中的优势类群，在土壤食物网中占据多个营养级地位〔2〕，其群落组成能够反映气候条件、土壤质地、土壤有机质输入以及自然和人为的扰动情况〔3〕。它们被视为一个地区生物多样性及其可持续性的指示生物，尤其是运用其评价土壤健康程度、土壤动物学效应、生态系统演替或外界干扰强度等〔4〕。

土壤线虫类群庞大、物种数量巨大，传统分类工作较为困难。线虫分离是对土壤线虫分类、进行形态和生态学研究的基础，分离率也限制了后续的研究〔5〕。根据不同的研究目的及原理，目前国内外对土壤线虫分离的方法主要分为3类：过筛法、悬浮法、贝尔曼漏斗法〔5〕，前两类分离方法得到的线虫悬液含有较多的土壤矿质颗粒和有机物残体，贝尔曼漏斗法分离得到的线虫悬液几乎无杂质，虫体干净完整、活性高，操作简单，方便后续的计数和鉴定，能大大降低实验的前期投入，被视为最节省时长，分离过程最简便，分离后杂质最少的分离方法〔5〕。该方法利用线虫的趋水性和自身重力，脱离土壤进入水中，因此分离率受时长的影响较大〔6〕。目前使用贝尔曼漏斗法对土壤线虫进行分离没有较为统一的分离时长，利用中国知网和Web of Science，本研究随机搜集了100项采用贝尔曼漏斗法分离线虫的研究，统计其使用的分离时长。结果发现各研究中分离时长极不统一（12～168 h），其中24 h和48 h使用频率较多，分别占40%和50%。见图1。

图1 100项研究中不同分离时长的使用频率

对贝尔曼漏斗法的最优分离时长选择、兼顾研究需求的同时减少不必要的时间投入等问题尚无系统研究。为探究贝尔曼漏斗法在土壤线虫分离过程中的最优分离时长，本研究基于贝尔曼漏斗法，对所采集的土壤样品进行线虫分离，分离过程中连续72 h收集分离出来的线虫，比较12、24、36、48、60、72 h分离时长下的累积分离率与分离种类，为贝尔曼漏斗法提取土壤线虫时分离时长的设定提供参考依据，帮助研究人员快速有效地完成实验，促进土壤线虫及其相关生态学的研究。

1 材料与方法

1.1 研究区概况样品采集地点苍山位于云南省大理市（99°58'～100°27'E，25°34'～26°00'N），地处低纬度山区，属亚热带高原季风气候，南北长950 km，东西宽19 km，总面积950 km2，海拔1 980～4 122 m。植被囊括云南松林及灌丛草坡带、华山林人工带、常绿栎类、杜鹃箭竹灌丛林、苍山冷杉林带、高山杜鹃灌丛草甸。生物多样性极为丰富独特，并具有明显的植物垂直分布带谱，使苍山成为南北生物交汇过渡带，生物的分布和分化中心，为全球生物多样性最为丰富的地区之一〔7〕。

1.2 研究方法

1.2.1 样点设置及样品采集在苍山黑龙溪海拔2 300 m处（100°14'E，25°67'N）设置3个采样点，每个采样点利用劈裂式采样器（直径38 mm）分别采集3个样品，样品仅选取土柱5～10 cm处的土壤，共采集土壤样品9份〔8〕。

1.2.2 土壤线虫分离将直径为10 cm的玻璃漏斗置于木架上，在漏斗内铺垫滤网，漏斗下管连接长约10 cm的橡胶管，距离橡胶管最末端1～2 cm处用止水夹夹紧。把每份土壤样品混匀后，去除肉眼可见的大石子和树根等杂质，平行称取50 g的土壤样品3份，分别置于加垫滤网的漏斗中，加入超纯水使土壤全部浸润，1 h后打开漏斗下端的止水夹收集分离出来的土壤线虫，然后关闭止水夹，再加入超纯水使土壤全部浸润。重复上述操作，每隔1 h取样1次〔8〕，直至72 h。将收集到的线虫溶液放置于100 mL的血清瓶中，72 h线虫收集完成后将线虫溶液定容至100 mL。

1.2.3 计数将血清瓶中溶液摇匀后，用移液枪吸取10 mL的线虫溶液至蛇形计数板中，在体视镜下用解剖针挑取线虫至细胞板中保存并用计数器计数。当所挑取的线虫数量大于150条/10 mL时，重复计数3次，取平均值后计算每个样品的线虫总数（100 mL线虫溶液中的线虫数量即为对应样品中的线虫总数）；若每次所取样品挑取的线虫数量不足150条/10 mL时则需完全取样，直至全部线虫溶液被挑取计数完毕为止。

1.2.4 装片制作将石蜡放置于培养皿中并在电热板上加热至融化，用自制的中空玻璃印章蘸取融化的石蜡，迅速盖在载玻片上，冷却后在载玻片中央形成一个密闭的石蜡圈，之后在石蜡圈中央滴1滴甘油，挑取不多于10条的线虫到甘油中，轻轻盖上盖玻片，并置于电热板上使石蜡融化，融化后移开电热板冷却，冷却后固化的石蜡将载玻片与盖玻片黏合，在制作好的装片上标记样品编号及装片编号后待检。

1.2.5 拍照与鉴定用CCD成像显微镜（尼康E100+奥林巴斯DP26 CCD采集器）拍摄土壤线虫的形态（唇、口针、食道球、生殖腺、阴门、尾及尾腺），同时测量线虫的体长、口针长度、最大体宽、体前端至食道与肠连接处的距离、尾长，并计算a=体长/最大体宽；b=体长/体前端至食道与肠连接处的距离；c=体长/尾长，用来辅助鉴定。分类鉴定参考《长白山森林土壤线虫》〔8〕《中国土壤动物检索图鉴》〔9〕及De nematoden van Nederland〔10〕，鉴定至属。

1.3 数据统计对分离得到的线虫进行累积计数（即2 h的结果为第1 h与第2 h结果的加和，3 h的结果为第1、2、3 h结果的加和，以此类推，直到第72 h），分别计算12、24、36、48、60、72 h的累积分离率。累积分离率=该时长累积分离线虫数量/72 h累积线虫总数量×100%。

线虫种类的鉴定每隔24 h鉴定1次，分别鉴定24、48、72 h所收集的每份样品的线虫种类。

1.4 营养类群划分依据Yeates等〔11〕的方法将线虫划分为4个营养类群：植食性线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、杂食-捕食线虫。

2 结果

2.1 土壤线虫群落组成及营养类群所有土壤样品中共分离得到土壤线虫24 777头，属线虫门2纲6目21科35属（其中有2科未鉴定到属）。在所处理的样品中，稀有类群分布于原杆属（Protorhabditis）、滑刃属（Aphelenchus）、螺旋属（Helicotylenchus）等26个科属中；常见类群中棱咽属（Rhabdolaimus）为食细菌线虫，其他均为杂食-捕食线虫；无优势类群。见表1。

表1 实验样品中土壤线虫的群落构成

2.2 不同分离时长下土壤线虫种类的分离差异从线虫的分离种类看，24 h与48 h之间差异无统计学意义（21.00±2.54 vs.21.00±1.00，n=9，P=0.817），说明24 h分离时长就可满足种类分离要求。

2.3 不同分离时长下土壤线虫的累积分离率实验结果显示在分离时长为12 h时，线虫的平均累积分离率为75.86%（69.99%～81.11%）；24 h平均累积分离率为97.09%（95.59%～98.35%）；36 h平均累积分离率已经到99.63%（99.17%～99.80%）。见图2。

图2 不同分离时长土壤线虫的累积分离率

3 讨论

本次收集到的线虫数量庞大、类群完整，包括植食性线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、杂食-捕食线虫，结论具有普适性且可靠，为贝尔曼漏斗法分离时长的设定提供了有力支持。就分离的种类而言，24 h的分离时长已经满足了实验的分离要求；就分离数量而言，36 h累积分离率达到99%以上，是最优的分离时长。综合分离种类及数量两方面的要求，我们建议贝尔曼漏斗法分离时长为36 h，这个时长与24 h相比，可多收集近3%的个体，分离完整性显著增加；而与48 h相比，可减少12 h的实验时长，较大程度降低了分离时间，兼顾了实验的工作量和可信度。

贝尔曼漏斗法利用线虫的蠕动和自身重力进行分离收集，要求被分离的线虫相对活跃，时间过长线虫死亡后也必定会影响分离效果，结果也显示36 h后线虫的累积分离率基本稳定。同时受到物种活动特性和样品送检时效性的限制，如果需要对土壤线虫进行较精确计数或采样送检时间间隔较长时，建议使用以浮聚为主要原理的线虫分离方法，虽该原理支持的方法实验步骤繁杂且耗时长，但对样品中线虫的活性没有要求。

基于分离种类而言24 h就已经达到了最大的分离效率，但基于分离数量考虑36 h才达到最佳的分离效率，综合评价土壤线虫的分离种类和数量，推荐贝尔曼漏斗法分离选取36 h的分离时长。本研究也提示，从采样至送检间隔时间过长且线虫活性无法保证的研究不宜使用贝尔曼漏斗法进行线虫分离。

致谢：感谢大理大学三江并流区域生物多样性保护与利用省创新团队、大理大学校级创新团队、云南省中国三江并流区域生物多样性协同创新中心和大理大学东喜玛拉雅研究院对本文提供的支持和帮助。