中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白试剂性能验证分析

孙江漫 李敏 邵燕 孟祥兆 陈宝荣 于洪远

作者单位：1 北京航天总医院检验科，北京 100076

2 北京金域医学检验实验室有限公司，北京 100015

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是一种小分子蛋白，由Kjeldsen 等[1]首次在中性粒细胞中发现，其位于染色体9q34 上，分子量25kD，属于脂钙蛋白家族。正常情况下，NGAL 在成熟外周血中性粒细胞和人体组织器官中的mRNA 表达较低。但在各种原因如肾毒性药物、造影剂、感染、心脏病、重大手术、糖尿病等[2]导致的急性肾损伤（Acute kidney injury，AKI）早期，血液、尿液中的NGAL 浓度显著升高，且与传统肾功能检测指标如血肌酐、血尿素氮、尿量等相比，NGAL 是一种更灵敏、更理想的早期肾功能损伤检测指标。因此，血液和（或）尿液中NGAL 浓度升高对AKI 的诊断、治疗和预后有重要的临床意义[3]。本研究通过对市售的NGAL试剂盒参数进行分析研究后最终选取两种试剂盒进行性能验证，并比较其不同检测系统结果的一致性，为NGAL 的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本20 份无溶血、黄疸、乳糜的临床剩余单人份血清样本，卫健委质控品（202011～202015）。

1.2 仪器日立7170 自动生化分析仪。

1.3 试剂迈克试剂检测原理是胶乳免疫比浊，试剂批号0819021，校准品批号0819021，质控品批号0619021；生之源试剂检测原理为胶乳增强免疫透射比浊，试剂批号19111458-A1，校准品批号20190808，质控品批号20190808。

1.4 方法检测前对仪器进行日常清洗、常规维护和保养。按照各试剂盒说明书在日立7170 自动生化分析仪上设置参数，通过常规方法对仪器和试剂进行校准，质控在控进行下一步验证。

1.4.1 正确度 目前国内外尚无NGAL 参考方法和标准物质，故通过检测卫健委质控品（202011～202015）评价两种试剂检测结果的正确度；再使用两种试剂同时检测20 份单人份血清样本，对检测结果进行配对t检验，以评估两种试剂检测结果的一致性。

1.4.2 精密度 参考行标WS/T 420-2013，检测2 个浓度水平（其中水平1 为正常值、水平2 为异常值）的患者血清样本及试剂自带高低值质控品，计算精密度是否符合试剂说明书的精密度要求，迈克试剂批内精密度要求≤8%，实验室不精密度≤10%；生之源试剂批内精密度要求≤5%，实验室不精密度≤10%。

1.4.3 线性 采用高低值血清样本评估线性，按照6H∶0L、5H∶1L、4H∶2L、3H∶3L、2H∶4L、1H∶5L、0H∶6L方式配置7 个浓度梯度。迈克试剂要求浓度在25～5 000ng/ml，相关系数r≥0.99，其中25～200ng/ml时偏差应在±20ng/ml 内；200～5 000ng/ml 时偏差在±10%范围内；生之源试剂要求浓度为25～3 000 ng/ml，相关系数r≥0.99，其中浓度为25～400ng/ml 时偏差应在±40ng/ml，400～3000ng/ml 时偏差在±10%范围内。

1.5 统计学分析使用SPSS 20.0 软件对数据进行分析，两种试剂的正确度结果进行配对t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种试剂正确度验证通过卫健委质控品检测可知，生之源试剂的检测结果与靶值的相对偏倚除最大值外均比迈克试剂大；迈克试剂除最大值外相对偏倚均在15%以内，而生之源试剂除最大值外均高于20%，但两种试剂均未超出卫健委统计结果的允许范围。见表1。

表1 卫健委质控检测两种试剂结果

2.2 两种试剂对患者样本的检测结果两种试剂的20 份单人份血清样本检测结果相比，差异有统计学意义（P=0.012）。两种试剂的检测结果有一定的偏差，但两种试剂的相对偏倚均小于卫健委统计的最大偏倚（30%）。见表2。

表2 两种试剂对20 份患者样本的检测结果（ng/ml）

2.3 两种试剂精密度验证在水平1、水平2、低值质控、高值质控上，迈克试剂批内精密度优于生之源试剂，而生之源试剂的实验室内不精密度优于迈克试剂；两种试剂高值精密度均比低值精密度高。但两种试剂测量的精密度均在各自要求的范围内。见表3。

表3 两种试剂精密度对比（%）

2.4 两种试剂线性验证迈克试剂线性验证结果示实测值与理论值无离群值，符合试剂说明书要求：浓度25～200ng/ml 时，偏差±20ng/ml；200～5 000ng/ml时偏差均在±10%内，见表4；相关方程y=1.02064x-68.66716，线性相关性良好（R2=0.99896），见图1。生之源试剂验证结果符合试剂说明书要求：浓度25～400ng/ml 时偏差±40ng/ml；400～3 000ng/ml 时，偏差在±10%内，见表5；相关方程y=0.99833x-14.0747，线性相关性良好（R2=0.99926)，见图2。

图2 生之源试剂线性验证

表5 生之源试剂线性验证结果

图1 迈克试剂线性验证

表4 迈克试剂线性验证结果

3 讨论

AKI 是各种严重疾病中最常见的并发症之一，因此早期诊断对AKI 的治疗至关重要。经典的AKI生化指标在肾功能发生不可逆损伤前不会发生明显改变，这增加了AKI 早期识别的难度，导致患者死亡率增加。AKI 患者血液和（或）尿液中NGAL 的表达明显升高，尤其是尿液中NGAL 水平与肾损伤严重程度密切相关，故NGAL 成为目前最有潜力的AKI 早期生化标志物。此外临床检测的准确性和可靠性是疾病诊断的基础。

如何保障临床实验室检测系统测量结果的准确性、可靠性是检验医学研究的重点，也是临床实验室质量管理的核心。量值溯源是目前实现各检测系统检测结果准确可靠的一种常规方法，量值溯源是指溯源至该检测项目的参考方法和标准物质[4]。基于目前国内外尚无NGAL 参考方法和标准物质，故通过卫健委质控品和20 份单人份血清样本评估两种试剂检测结果的正确度和一致性。两种试剂通过检测卫健委质控品可知迈克试剂检测结果的相对偏倚较生之源试剂小，但都在卫健委统计的允许范围内。两种试剂检测20 份同一单人份血清样本的结果有显著性差异，说明两种试剂检测结果还是有一定的偏差。因为NGAL 尚无参考方法和标准物质，各试剂厂商就无法实现量值溯源[5]，导致各试剂检测结果无法标准化，所以检测结果会有偏差，卫健委的统计结果范围也较大。所以即使两种试剂检测结果有偏差但也均在卫健委统计范围内，另外迈克试剂的正确度略优于生之源试剂。对于精密度，迈克试剂批内精密度优于生之源试剂，而生之源试剂的实验室内不精密度优于迈克试剂，但都在其要求的范围内，均满足临床要求。两者的线性相关性良好，均符合其说明书规范。

综上所述，各试剂的性能良好，只是因为缺乏可溯源的途径导致正确度有一定差异，故我们需要尽快研究NGAL 的参考方法或标准物质来验证其检验结果的一致性和可比性，为临床提供更准确的结果，以便于疾病的诊断和治疗。