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利格列汀凝胶的大鼠体内药动学研究

2022-01-17肖学成邢天嫣曹国胜

关键词:格利血药浓度血浆

肖学成,邢天嫣,曹国胜,卢 山,向 兰

(1.湖北中医药大学药学院,湖北 武汉 430065;2.浙江大学药学院,浙江 杭州 310058)

糖尿病(Diebetes mellitus, DM)是一种常见的内分泌型代谢性疾病,无论个体处于哪种社会地位或拥有哪方国籍,鉴于目前没有根治糖尿病的特效药,对所有患病者来说,它对健康和寿命延长都产生巨大威胁.2019年全球糖尿病联盟数据库显示,目前不完全统计糖尿病人数超4.5亿,比加拿大和美国人口总数多出几千万,逼近整个欧盟人口总和,从人均角度来说,全球每10个普通人中就有一位糖尿病患者[1].随之而来的是人类作为命运共同体必须面临为了糖尿病所承担的医疗开支,在2019年高达一千六百多亿美金,26年后这个数值将至少增长14%,逼近两千亿美金大关.除5%~10%其他类型糖尿病的病者外,其余的均为2型糖尿病[1].二型糖尿病最大的问题在于体内缺乏胰岛素分泌或由此引发胰岛素不足,患者长期处于血糖在高位运行状态,直接导致全身血管系统、神经中枢和其他组织及器官的长期慢性损伤,最终引发功能性障碍[2-4].

目前,糖尿病的治疗主要采取注射胰岛素及降低血糖.用于控制血糖的一线药物主要有二甲双胍及利格列汀等.利格列汀(linagliptin),化学名8-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔基-1)-3,7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1H-嘌呤-2,6-二酮,可溶于水中,在甲醇和乙醇中微溶.利格列汀对DDP-4抑制作用为可逆的竞争性抑制作用[5-6],与其他列汀类药物相比,利格列汀对DDP-4的选择性相较于DDP-8和DDP-9高出一万倍以上.与其他DDP-4抑制剂相比,它对葡萄糖耐受有更持久改善[7],且肝肾功能不全2型糖尿病患者无需调整用量[8-9].但近年来美国自发呈报系统AERS和WHO的VigiBase数据库均报告口服利格列汀片剂患者对肠胃道造成损害(AERS系统报告胃肠副反应占首位)[10-11],中文说明书中禁忌症栏未强调此现象并提醒患者关注.因此,我们考虑通过改变剂型及给药方式来改善这些临床上的不良反应.透皮给药可有效避免患者因口服给药对胃肠造成损伤,且凝胶温和有一定缓释作用,有利于提高患者用药顺应度.

为提高患者用药安全度,克服利格列汀口服片剂引起胃肠道副反应,部分高龄老年患者口服吞咽困难等缺陷[12-13],课题组前期研究显示利格利汀自制凝胶体外透皮有缓释效果,因此利用高效液相色谱建立大鼠血浆中利格利汀含量测定方法,以此对比利格利汀口服和凝胶给药半衰期和体内的平均滞留时间,为进一步开发利格利汀透皮制剂和临床应用提供相关依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈(美国天地有限公司,色谱级),甘油、三乙醇胺、羟苯乙酯、CMC-Na、三氟乙酸、乙酸乙酯、EDTA-Na、NaOH(国药集团有限公司,分析级),医用无纺布胶带(淄博康迪医疗器械有限公司),医用无菌敷贴(青岛海诺生物工程有限公司),利格利汀对照品(Polpharma,批号:101071826,纯度>98%),卡波姆980(固安希星药业有限公司),二乙二醇单乙醚(法国嘉法狮公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)

1.2 仪器与设备

高效液相色谱(大连伊利特分析仪器有限公司),离心浓缩仪(太仓市科教器材厂),超声波(上海波龙电子设备有限公司),循环水多用真空泵(郑州长城科技工贸有限公司),电子天平(赛多利斯北京科学仪器有限公司),高速离心机(Thermo),电子天平(赛多利斯北京科学仪器有限公司),-30 ℃冰箱(中科生明科技股份有限公司),高速离心机(美国Thermo公司),台式低速离心机(北京京立离心机有限公司),涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)

1.3 实验动物

SD大鼠,雄性,6只,体重170 g±20 g,浙江医学科学院实验动物中心提供,饲养及管理均严格按照实验动物的要求及相关的浙江大学饲养规定.饲养许可证号SYXK(浙)2012-0178.

2 方法与结果

2.1 利格利汀对照品纯度鉴定

取利格列汀适量配成饱和溶液,20 μL移取到干燥洁净玻璃瓶后旋干,根据参考文献用CD3OD将化合物溶解后装核磁管送样,将所得结果与参考文献数据[14]对比后进行判断,见表1.

表1 利格列汀氢谱数据分析

由上述数据可知,1H NMR图谱中除溶剂峰外并无其他明显杂峰,实验中所用利格利汀对照品纯度如说明书中所示,纯度>98%,可用于后续的生物样品实验测定.

2.2 利格列汀凝胶剂的制备

根据课题组探索得到的处方,称取1 g卡波姆980在纯净水中溶胀过夜,加入混合均匀的甘油(10.0 g)和羟苯乙酯(0.1 g).精密称取利格利汀0.1 g溶于5.9 g二乙二醇单乙醚中.上述两相相互混合后加入三乙醇胺适量调节pH范围在6.0±0.5内,加水至100 g即得.

2.3 血浆中利格利汀含量测定方法

2.3.1 色谱条件

色谱柱为H&E SP ODS-TA(4.6×250 mm);流动相A为0.1%TFA,流动相B为甲醇∶乙腈=1∶1(A∶B=55∶45);55%流动相A,流速1.0 mL/min;检测波长:295 nm;进样量:20 μL.

2.3.2 对照品溶液的制备

精密--称取利格列汀对照品溶液17 mg,置10 mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得;精密量取适量上述制得液体,用甲醇定量稀释刻度为5~1 000 ng/mL的利格列汀系列对照品溶液.

2.3.3 血浆样品前处理

取血浆样品0.1 mL,加入100 μL 1 M氢氧化钠溶液,涡旋30 s,在-20 ℃冰箱冻存过夜后,加入3 mL乙酸乙酯,涡旋2 min,2 500 r/min离心27 min后取上清液,离心浓缩机中旋干,取出后恢复至室温,再用100 μL甲醇复溶,超声10 min,2 500 r/min 离心12分钟后取上清液20 μL进样.

2.3.4 方法学考察

(1)专属性考察

分别取大鼠空白血浆、利格利汀对照品溶液、大鼠口服1 h后血浆样品,大鼠凝胶给药后1 h血浆样品,按2.3.3项下方法制备样品HPLC分析,记录色谱图.利格利汀保留时间约为7.6 min,大鼠口服和凝胶给药后利格利汀保留时间也在7.6 min附近,且该色谱条件样品峰不受内源性物质干扰,专属性强(见图1).

(2)线性回归考察

利用2.3.2项下不同浓度对照品标准液加入0.1 mL空白血浆中,样品处理依据2.3.3项,进行色谱分析后得到对应峰面积,所得回归方程式为Y=0.0438X+0.1653(R2=0.9905),说明血浆中利格利汀浓度在5~1 000 ng/mL范围内,线性方程满足药动学要求.利格利汀定量下限为5 ng/mL.

(3)精密度与准确度

用大鼠空白血浆配制成10 ng/mL,100 ng/mL,1 000 ng/mL的三个高中低浓度的样品,每个浓度含3个样本,按照血浆样本处理方法,连续分析三天,根据所得的标准曲线,分别计算质控样品的浓度,并得到日内和日间精密度及相对标准差(见表2).

表2 精密度和精确性结果

利格列汀日内精密度在93.4~98.6%范围内,相对标准偏差在3.4~9.3%内符合标准.日间精密度在92.3~101.3%范围内,相对标准偏差在6.1~8.7%范围内,符合标准.上述数据说明利格利汀在血浆中用此次建立的高效液相分析方法检测,具有良好的日内和日间精密度和精确性.

(4)回收率

取含利格列汀三个不同浓度的血浆样品,每个浓度6样本分析,按2.3.3项下血浆样品处理方法进行分析,测定利格列汀峰面积,分别与流动相配制成的相同浓度的对照品溶液峰面积进行对比,计算利格列汀的提取回收率(见表3).

表3 提取回收率结果(n=6)Table 3 Results of extraction recovery(n=6)

利格利汀在血浆中低、中、高浓度的样品回收率分别是80.9%,83.1%,82.3%,相对标准偏差分别为1.9%,2.3%,3.7%.利格利汀血浆样品的不同浓度回收率稳定在80.9~83.1%范围内,证明血浆中利格利汀样品的处理方法稳定性良好.

(5)稳定性

根据利格列汀特性,将含有利格列汀的三个梯度浓度的血浆样品,每个浓度6个样本分析,进行室温(25 ℃)、冰冻(-20 ℃)和冻融条件下稳定性考察,确定利格列汀血浆样品存放条件(见表4).

表4 稳定性结果(n=6)

在室温条件下利格利血浆样品在室温下存放24 h内和在-20 ℃冰箱内冻存15天利格利汀稳定性好,未见明显含量下降.3次冻融后利格列汀含量在血浆中保持稳定.血浆中利格利汀回收率范围在93.4±2.3%~102.1±5.3%内.

2.4 大鼠血浆药代动力学参数

2.4.1 给药方案和血样采集

将SD大鼠适应性喂养1周,口服给药组(n=3)灌胃利格列汀1%CMC-Na悬溶液,剂量10 mg/kg,在0、0.5、1、1.5、2、4、6、12、24、48 h眼眶取血0.5 mL,置EDTA-Na抗凝管中,1.2×1 000 rpm离心15 min分离血浆,于-20 ℃保存至分析测定.

凝胶透皮给药组(n=3)大鼠剃毛皮肤裸露后,在背臀部给予利格列汀凝胶(含量为100 g中有100 mg利格列汀原料药),给药剂量为10 mg/kg,给药面积(3 cm×4 cm),给药区域鼠皮表面,用敷贴后再加胶带缠绕三圈,48 h实验结束后除去外敷材料.经皮给药前取血点命名为T0,之后0.5、1、1.5、2、4、6、12、24、48 h眼眶取血0.5 mL,毛细管引流后注入含有EDTA-Na 的1.5 ml的离心管中.

口服组和凝胶组所得血样静置40 min后,1.2×1000 rpm离心15 min,分离血浆,精密移取100 μL血浆至5 mL离心管中,放入-20 ℃冰箱冻存.分析前按2.3.3项对样品处理后进样,记录相关数据.

2.4.2 大鼠口服利格列汀药代动力学

大鼠单次给药灌胃剂量为10 mg/kg,测定的利格利汀血药浓度-时间曲线如图2所示,根据各时间点对应的血药浓度折线图可知,在口服利格列汀0~1.5 h之间血药浓度迅速上升,2 h后利格利汀血药浓度快速下降,10 h后血药浓度逐渐趋于平稳,至48 h在体内仍能检测到血浆中含有的利格利汀.

图2 利格利汀血药浓度时间曲线(口服组)

利用PKsolver 2.0软件(中国药科大学)[15],采用非房室模型拟合大鼠单次口服利格利汀血药浓度-时间数据,计算得到相关药代动力学参数见表5.

表5 大鼠(n=3)口服组主要药动学参数

如表5中所示,3只大鼠最大血药浓度Cmax为983.212±32.263 ng/mL, AUC(0-t)为5 731.935±265.959 ng/mL*h,AUC(0-inf)为7 407.036±594.139 ng/mL*h,t1/2为29.077±4.847 h,MRT为30.415±5.310 h.

根据利格利汀口服给药数据,说明在2小时内药物被动物吸收,但根据MRT数据说明体内消除时间较长.

2.4.3 大鼠透皮(凝胶)利格列汀药代动力学

大鼠单次凝胶给药剂量为10 mg/kg,测定的利格利汀血药浓度-时间曲线如图3所示,根据各时间点对应的血药浓度折线图可知,在口服利格列汀0~1.5 h之间血药浓度迅速上升,1.5~10 h间利格利汀血药浓度快速下降,10 h后血药浓度逐渐趋于平稳,至48 h在体内仍能检测到血浆中含有的利格利汀.

图3 利格利汀血药浓度时间曲线(凝胶组)Fig.3 Linagliptin concentration-time curve( gel group )

利用PKsolver 2.0软件(中国药科大学),采用非房室模型拟合大鼠单次口服利格利汀血药浓度-时间数据,计算得到相关药代动力学参数见表6:

表6 大鼠(n=3)凝胶组主要药动学参数

如表6中所示,3只大鼠最大血药浓度Cmax为863.011±66.053 ng/mL, AUC(0-t)为4362.826±142.086 ng/mL*h,AUC(0-inf)为5655.167±273.662 ng/mL*h,t1/2为31.231±4.197 h,MRT为31.370±4.282 h.

3 讨论

此次结合文献优化出一种检测血浆中利格列汀的HPLC方法,且100 μL血浆用量少对动物伤害较小,采用乙酸乙酯作为萃取溶剂,同时加入1M 氢氧化钠使血浆碱化,提升了利格列汀回收率≥ 80.9 %,在选定的295 nm下无明显干扰峰.利格列汀血浆检测时先用HPLC收集目标峰,再用LC-MS 295 nm下确认其分子量,该外标法测定利格利汀在血浆中药物浓度流程简洁[16-17],且相关参数满足药动学参数要求[18].

由2.4项药代动力学实验结果可看出,利格利汀凝胶经皮给药,血浆中达峰时间与口服一致,但半衰期较口服组长约2小时,MRT比口服延长约1小时,说明利格利汀凝胶组在体内吸收与常规给药相似,但消除稍慢,可能是凝胶在角质层或真皮层形成药物储库,使得利格列汀药物在皮内一定深度缓慢释放.其一,针对这一现象,需要进一步利用荧光标记等技术探索药物确切的积蓄部位,同时着手对动物皮肤组织进行生理学解剖,观测一段时间内积蓄药物对皮肤组织产生的影响,比如因积蓄引发病变.其二,鉴于MRT时间延长,需要对动物体内各组织中利格利汀浓度进行检测,尤其是脑、脾、心脏、肺、肝、肾、胃、小肠等组织,探索利格利汀凝胶给药后在各组织分布与口服的差异.其三,根据上述结果,需要进一步研究利格列汀在剂型改变导致体内半衰期延长后,降糖效果是否与普通口服给药一致.若药效差异化较大,在保持缓释优势的前提下,应考虑进一步优化处方.以期能减少患者给药频率,提升顺应性降低患者用药方面的经济负担.

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