大蒜素在替莫唑胺诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用及其机制研究

陈景南 王承 杜杭根

胶质瘤是一种常见的脑肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的30%[1]。近年来虽然治疗技术有了很大的提高，但整体疗效始终欠佳，因而迫切需要探索新的有效疗法[2]。临床实践表明，替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一种DNA烷基化抗肿瘤药，能起到延缓肿瘤进展、延长患者生存期等作用，目前是用于神经胶质瘤的一线治疗药物。但是最近研究表明，TMZ的治疗效能因肿瘤的化学耐药性而受到限制，这已成为治疗神经胶质瘤的主要障碍[3-4]。因此，研究TMZ耐药的潜在机制迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要生物活性成分，已有多项研究证明其对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。在前期研究中，笔者同样发现大蒜素具有抗胶质瘤的作用。然而，大蒜素能否促进TMZ耐药的脑胶质瘤细胞凋亡，增强TMZ的化疗敏感性，目前尚未见报道。本研究选取TMZ耐药的脑胶质瘤细胞系U87/TMZ作为研究对象，探讨大蒜素在TMZ诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用及其机制，为大蒜素更好地应用于临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂 TMZ耐药脑胶质瘤细胞系U87/TMZ、FBS（上海赛百慷生物技术股份有限公司）；大蒜素、抑制剂 LY294002(美国 Sigma公司)；TMZ(规格：100 mg，批号：H20130603，济宁泰诺化工有限公司)；抗磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-AKT）抗体、抗蛋白激酶（protein kinase，AKT）抗体、抗基质金属蛋白酶抑制剂（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）1抗体、TIMP2抗体、抗基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗体、MMP-9 抗体（美国Cell Signaling公司）；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 实验分组与处理 体外培养U87/TMZ，待细胞生长至对数生长期后随机分为4组，分别加入0、10、25、50 mg/L的大蒜素，置于含1%FBS的DMEM培养基中培养24 h，收集细胞并检测磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 相关蛋白表达、TIMP1及MMP-2等相关蛋白表达及细胞凋亡率；加入50 μM抑制剂LY294002处理细胞1 h，收集细胞并检测细胞凋亡率。

1.3 相关蛋白表达检测 采用Western blot法。（1）PI3K/AKT相关蛋白表达检测：收集上述4组细胞，用RIPA细胞裂解液裂解，在4℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液，即蛋白质样品。使用BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质含量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质样品并转移到聚偏二氟乙烯膜上。转移后，膜在封闭溶液中孵育，加入抗p-AKT抗体，4℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应二抗，室温孵育2 h后再次洗涤5 min×3次，于暗室发光。以AKT为内参对照，实验重复3次，取平均值。（2）TIMP1、MMP-2等相关蛋白表达检测：大蒜素25 mg/L处理24 h后收集细胞，其余操作同上述步骤；其中加入的抗体为抗MMP-2抗体（1:500）、抗 MMP-9抗体（1:500）、抗 TIMP1抗体（1:500）、抗 TIMP2抗体（1:500），内参对照为GAPDH。

1.4 细胞凋亡率检测 采用MTT法。将细胞接种于96孔板，孵育过夜，次日加入10、25、50 mg/L大蒜素，5% CO2、37 ℃孵育 24 h，加入 20 μl MTT 溶液（浓度为5 mg/L）继续培养4 h，离心后弃液，PBS冲洗2～3次，再加入含MTT的培养液。小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶液，置摇床上低速震荡约10 min，使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测量吸光度值。以二甲基亚砜处理的细胞作为对照，计算细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。不同浓度大蒜素处理细胞后PI3K/AKT相关蛋白表达量、细胞凋亡率比较采用单因素方差分析；0、25 mg/L大蒜素处理细胞后TIMP1、MMP-2等相关蛋白表达量比较采用两独立样本t检验；LY294002阻断前后细胞凋亡率比较采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度大蒜素处理细胞后PI3K/AKT相关蛋白表达量比较 随着大蒜素浓度的增加，p-AKT蛋白表达量明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 不同浓度大蒜素处理细胞后磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/抗蛋白激酶（AKT）相关蛋白表达的电泳图（p-AKT为磷酸化AKT）

2.2 0、25 mg/L大蒜素处理细胞后TIMP1、MMP-2等相关蛋白表达量比较 与0 mg/L组比较，25 mg/L组TIMP1、TIMP2蛋白表达量均明显增加（均P＜0.05），而MMP-2、MMP-9蛋白表达量均明显减少（均P＜0.05），见图2。

图2 0、25 mg/L大蒜素处理细胞后抗基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）1、抗基质金属蛋白酶（MMP）-2等相关蛋白表达量比较（与0 mg/L组比较，*P＜0.05）

2.3 LY294002阻断前后细胞凋亡率比较 与阻断前相比，10、25、50 mg/L 组加入抑制剂 LY294002 阻断后，细胞凋亡率均明显升高（均P＜0.05）；随大蒜素浓度增加，细胞凋亡率逐渐升高（P＜0.05），见图3。

图3 LY294002阻断前后细胞凋亡率比较（与阻断前比较，*P＜0.05）

3 讨论

神经胶质瘤是目前最常见的一种原发性脑肿瘤，大多数恶性神经胶质瘤具有高度增殖性和浸润性，因而治愈率通常较低[5-6]。另外，神经胶质瘤患者的预后不容乐观，中位总生存期约为12个月[7]。目前胶质瘤的主要治疗手段是手术切除，但神经胶质瘤难以通过手术完全切除。尽管TMZ、顺铂等化疗药物对神经胶质瘤具有抗肿瘤作用，但由于其固有性和获得性耐药，大多数神经胶质瘤患者对化疗的反应较差。因此，如何增强对TMZ的敏感性是研究重点。大蒜素具有明显的抗癌功效，可作为各种肿瘤（如胃癌、肺癌、胶质瘤等）的一线化疗药物[8]，故本实验拟研究大蒜素在TMZ诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用及其机制。

PI3K/AKT信号通路是神经胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭的关键调控途径。近来研究表明，可能与程序性死亡受体1可以优先与多种PI3K/AKT信号传导蛋白结合有关，其可导致细胞侵袭的促进和免疫应答的抑制[9]。关于PI3K/AKT信号通路对TMZ敏感性的影响，Huang等[10]认为激活的PI3K/AKT信号通路是胶质母细胞瘤干细胞中miR-223/PAX6介导的TMZ敏感性降低的原因。据报道，抑制PI3K/AKT信号通路后，TMZ敏感性也得到增强[11]。本研究结果显示，加入大蒜素后，U87/TMZ细胞中PI3K/AKT信号传导通路活化情况明显减弱，且随着大蒜素浓度的增加而逐渐降低，这表明TMZ耐药与PI3K/AKT信号传导通路活化有关，而大蒜素的作用在于降低其活化性，从而提高TMZ治疗胶质瘤的疗效，增强其敏感性。另外，本研究加入PI3K/AKT信号传导通路的抑制剂LY294002后，细胞凋亡率明显升高，也说明PI3K/AKT信号传导通路与TMZ耐药密切相关。

脑胶质瘤侵袭是一个复杂的病理、生理过程，与多个基因的改变密切相关。MMP是一个肽链内切酶家族，依赖Zn2+发挥作用，主要在细胞外基质中起降解作用，破坏肿瘤细胞的组织学屏障。MMP-2、MMP-9是一种胶原酶，是MMP家族中的主要成员，参与肿瘤侵袭转移、血管新生、抑制细胞凋亡等过程。因此，MMP-2和MMP-9被认为是开发抗癌药物的重要靶标。TIMP是由TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4组成的哺乳动物蛋白家族，它们共同显示广泛的序列同源性和结构相似性。据报道，TIMP是天然的MMP抑制剂，可通过取消金属蛋白酶家族所有活化成员的水解活性来防止细胞外基质的降解[12-13]。MMP和TIMP的异常表达可能会影响基质蛋白的重构、形成和降解，诱导癌细胞的侵袭。本实验在耐药细胞中加入大蒜素后，TIMP1、TIMP2蛋白表达量均明显增加，而MMP-2、MMP-9蛋白表达量均明显减少，这表明MMP和TIMP之间具有平衡性，并且大蒜素具有改变TIMP/MMP平衡的作用。

综上所述，脑胶质瘤细胞对TMZ的耐药与PI3K/AKT信号传导通路活化有关，而大蒜素能够提高TMZ治疗脑胶质瘤的疗效，增强TMZ的敏感性，其作用机制是通过阻断 PI3K/AKT信号传导通路，上调TIMP1、TIMP2表达并下调MMP-2、MMP-9表达，从而改变TIMP/MMP平衡，发挥治疗作用。这为临床耐TMZ的脑胶质瘤患者化疗药物的筛选提供了新的思路，并为大蒜素用于临床治疗胶质瘤提供理论依据。