先兆子痫脑源性神经营养因子检测的临床意义

黄宝丽，黄雪滢，许秋芳，徐慧丽，王永珍，杜建钢

先兆子痫（preeclampsia，PE）是初产妇最常见的一种妊娠期疾病，常伴机体多系统功能损害，导致母体易出现严重心脑血管并发症，并使新生儿出现低出生体重、发育不成熟等方面的不足，是造成产妇以及围产儿死亡的重要原因之一［1］。脑源性神经细胞营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中的重要成员，研究表明，BDNF不仅能促进神经元的发育和分化、细胞存活及突触可塑性，同时具有抗凋亡、抗氧化、抑制自噬等神经保护作用［2-4］。除此之外，还可以在妊娠期期间调节胎盘中的血管变化，促进血管生成，胎盘发育和胎儿生长［5］。BDNF的表达受氧化应激和炎症反应的调节，同时又调节炎症反应，其浓度的改变可能参与了PE的发病机制［6］。本研究通过检测PE患者及健康孕产妇血清中BDNF水平及其单个核细胞mRNA的表达，评估BDNF在先兆子痫患者诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年11月～2019年4月苏州市立医院本部入院的PE患者及健康孕妇各45例为研究对象。其中，PE组年龄21～43岁，平均年龄（29.89±5.02）岁，孕周25～40周，平均孕周（33.71±4.04）周。纳入标准：采用《妇产科学》诊断标准，妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或随机尿蛋白（+）［7］。排除标准：合并慢性高血压病、糖尿病、肝肾等脏器功能障碍、感染性疾病等并发症。健康孕妇45例为对照组，年龄20～38岁，平均年龄（30.02±4.40）岁，孕周24～40周，平均孕周（35.31±4.13）周。PE期组与对照组年龄及孕周差异无统计学意义（P＞0.05）。两组基本资料比较见表1。本研究经医院伦理委员会批准同意。

表1 PE组与对照组基本资料比较（±s）

表1 PE组与对照组基本资料比较（±s）

项目 收缩压（mmPE组 对照组 t值 P值Hg） 149.56±13.85 121.76±12.48 10.002 0.000舒张压（mmHg） 94.53±12.30 72.30±7.30 10.518 0.000 BMI（kg/m2） 28.51±3.20 26.31±3.77 2.990 0.004

1.2 主要仪器及试剂KDC-2046低速冷冻离心机（合肥中科中佳），SC-3610台式低速离心机（合肥中科中佳）,eppendorf-centrifuge 5430R低温高速离心机（德国eppendorf公司），酶标仪Magellan for F50（奥地利TECAN公司），GeneAmp PCR System扩增仪（美国ABI公司），Step One实时荧光定量PCR扩增仪（美国ABI公司），eppendorf-centrifuge 5430R低温高速离心机（德国eppendorf公司）；人BDNF ELISA试剂盒（武汉博士德公司），Ficoll淋巴细胞分离液（上海恒信化学试剂有限公司），TRNzol Universal总RNA提取试剂 （北京天根公司），FastKing RT SuperMix cDNA逆转录试剂盒（北京天根公司），SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（北京天根公司）。

1.3 样本采集及保存 于患者入院时抽取空腹静脉血，EDTA-K2抗凝血（紫色管）2.0 ml和黄色分离胶真空促凝管4 ml。黄色促凝管常温静置30 min后，以离心半径17.0 cm、3 500 r/min离心10 min，取上清分装保存于-80℃冰箱备用。操作于标本采集2 h内完成。

1.4 检测方法

1.4.1 血清BDNF的检测 依照BDNF ELISA试剂盒说明书操作测定血清BDNF含量。

1.4.2 BDNF mRNA的检测

1.4.2.1 外周血单个核细胞的分离 将稀释好的外周血用一次性滴管吸取后，沿管壁缓慢加入准备好的3 ml Ficoll淋巴细胞分离液。水平离心机（离心半径16.0 cm）500×g离心20 min。吸取中间云雾状白膜层单个核细胞，加入1.5 ml离心管中，以离心半径11.0 cm、10 000 r/min离心1.5 min，弃上清。加入1 ml生理盐水，混匀后10 000 r/min，离心1.5 min，弃上清。加入1 ml TRNzol Universal试剂。

1.4.2.2 RNA抽提 依照TRNzol Universal总RNA提取试剂操作说明书进行。应用紫外分光光度计测定RNA在波长260 nm、280 nm的吸光度，A260/A280比值在1.8～2.0之间。

1.4.2.3 cDNA第一链合成 利用FastKing RT SuperMix cDNA逆转录试剂盒合成cDNA第一链：在50 μL的PCR反应管中加入4 μL 5×FastKing-RT SuperMix，4 μL Total RNA，12 μL RNase-free ddH2O。充分混匀并低速（1 200×g）离心1 min，于PCR扩增仪上42℃15 min，95℃3 min进行反应。

1.4.2.4 PCR反应 使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒和Step One PCR扩增仪进行实时荧光定量。反应体系：12.5 μL 2×SuperReal PreMix Plus，0.75 μL正向引物（10 uM），0.75 μL反向 引 物（10 uM），2 μL cDNA模 板，2.5 μL 50×ROX Reference Dye△，6.5μL RNase-free ddH2O。BDNF基因的上游引物：5'-AGTGCCGAACTACCCA GTCGTA-3'，下游引物：5'-CTTATGAATCGCCAGCC AATTC-3'，扩增产物长度为98 bp；内参基因β-肌动蛋白上游引物：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'，下 游 引 物：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，扩增产物长度为261 bp［8］。引物由上海闪晶生物技术研究所合成。扩增条件如下：95℃预变性15 min；95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，共40个循环。每个标本做3个平行复孔，取Ct平均值。单个样本BDNF基因表达量用相对β-肌动蛋白的Ct差值表示。差异表达的相对定量分析用2-ΔΔCt法。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，非正态分布资料两组样本间比较采用Mann-Whitney U秩和检验，结果采用中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示；正态分布计量资料两组样本间比较采用独立样本t检验，数据采用（±s）表示。采用Pearson相关性分析BDNF与其它临床参数间的相关性。采用logistic回归分析PE与多个危险因素的关系，所有统计学均为双侧概率检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PE组与对照组BDNF水平变化PE组与对照组血清BDNF含量及单个核细胞中mRNA相对表达含量2 360.40（1 916.02～2 804.60）pg/ml、1.71±0.76，均低于对照组2 974.67（2 296.17～3 728.67）pg/ml、2.76±0.99，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 BDNF与PE患者临床参数的相关性分析BDNF与患者的孕周、血压、BMI指数均无明显相关性（P＞0.05），血清BDNF与患者年龄呈负相关（P＜0.05）。血清BDNF与单个核细胞mRNA表达正相关（r=0.424，P=0.004）。

2.3 血清BDNF在PE患者中的诊断效能评价 血清BDNF及BDNF mRNA诊 断PE的ROC曲线显示，二者ROC下面积分别为0.685（0.578，0.779），0.800（0.703，0.877）。

2.4 影响PE的多种危险因素分析 以是否患有PE为应变量Y（有为1，没有为0），年龄、BMI、收缩压、舒张压、血清BDNF含量为自变量（X1-X5），建立回归方程，logistic回归分析结果显示：收缩压、舒张压、BDNF含量是影响PE的危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 PE患者危险因素logistic回归分析

3 讨论

广义的炎症反应激活在PE的发病机制中起重要作用。PE的发生分为两个阶段，第1阶段是胎盘功能障碍，第2阶段是由功能障碍的胎盘产生炎性因子，激活全身炎症反应，进而导致PE的发生［9］。已有研究显示，PE患者胎盘BDNF基因表达的下调，这可能与免疫和氧化/抗氧化机制缺陷以及内源性ω-3脂肪酸浓度降低等原因有关［10］；另有研究显示BDNF可通过缺氧诱导因子-1α诱导血管内皮生长因子发挥作用，在妊娠期间调节胎盘中的血管生成［11］。本研究显示PE患者血清BDNF含量及mRNA表达均明显低于健康对照组，研究结果与Perucci等［6］及Cai等［8］的 结 论 一 致，原 因 可 能 与BDNF的下调影响PE患者的血管生成因子，以及与氧化应激和炎症反应的调节等机制有关。

另外，本研究对PE患者的临床资料与BDNF含量做了相关性分析，结果显示血清BDNF含量与PE患者的年龄呈负相关，与患者的血压、BMI指数均无明显相关性。Lommatzsch等［12］的研究显示，血浆中BDNF的水平随着年龄的增加显著降低，本研究结果与其一致，原因可能与年龄会影响前体BDNF向成熟BDNF的转换有关。通过ROC曲线分析血清BDNF及BDNF mRNA诊断PE的效能，二者ROC下面积为分别为0.685，0.800，提示BDNF mRNA的诊断效能较前者高。此外，本研究采用Logistic回归分析了PE与多个危险因素的关系，结果显示血压升高、BDNF含量下降可能是影响PE的危险因素。

血清BDNF检测在PE患者的诊断中有一定的价值，其含量降低可能是PE发病的危险因素之一。BDNF与PE患者的临床严重程度及相关并发症如可复性脑损伤等的关系需扩大入组样本量进行进一步评估，与患者预后监测及围产儿结局等的相关性需要在此基础上开展进一步的基础性研究以及大规模的前瞻性研究。