核桃青果皮栲胶提取工艺优化及其品质评价

张时馨，刘亚娜，耿阳阳，王纪辉，胡伯凯，何佳丽，杨 霞，谭化美

（1.贵州省核桃研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005）

栲胶是从植物的皮、根、茎和果实中提取的具有鞣制作用的混合有机物，有效成分是单宁[1-3]。栲胶作为一种天然植物鞣剂，是制革工业中不可缺少的一种原材料[4-5]。目前，在皮革生产中已得到广泛应用的栲胶品种主要有毛杨梅栲胶[6]、落叶松栲胶[7]、橡椀栲胶[8]等，并已有相应栲胶品种的行业标准规范及其质量要求。随着制革工业的发展，市场对栲胶的需求量逐步增加[4]，现有的植物栲胶提取方法工艺繁琐、耗时长、提取率低、原料消耗大，每生产1 t栲胶，需消耗2.3～3.2 t橡椀[9]。因此，寻找单宁含量丰富、可生产栲胶的优质新原料迫在眉睫。

核桃Juglans regia作为我国重要的木本粮油植物，种植面积广泛，产量巨大。据报道，2010年我国核桃坚果产量为116万t[10]，到2016年已超过270万t[11]，随之产生的大量核桃青果皮成为农业废弃物堆放在田间、地头或沟边，造成了一定的资源浪费和环境污染，将其充分高值化利用是解决这一现状的有效途径。目前，关于核桃青果皮多酚和黄酮类物质的抗氧化和抑菌活性[12-13]的研究报道较多，有关核桃青果皮中单宁的研究主要集中在提取方法和工艺条件优化等方面。有研究结果表明，与邻菲罗啉分光光度法相比，采用Zn2+络合法测定的核桃青果皮单宁含量提高了15.18%[14-15]。王红等[16]采用超声波辅助提取的核桃青皮单宁含量可达10.49 mg/g。这些方法虽然提高了单宁含量，但较为繁琐，且这些研究中未对栲胶品质及其鞣制效果进行分析，栲胶中除了单宁外，含有的非单宁物质以及不溶物等极易影响栲胶品质，从而制约了栲胶的工业化应用。在我国栲胶的品质标准中规定：橡碗栲胶一等品（冷溶）的标准为不溶物含量不大于2.5%，合格品中的不溶物含量不大于3.5%，pH范围均要求在3.3～4.0；马占相思栲胶一等品的不溶物含量不大于4.0%，合格品中的不溶物含量不大于6.0%[17]。因此，高值化利用农业废弃物，开发新的栲胶原料，不断改进栲胶生产工艺，对所提取栲胶进行品质评价，可为栲胶产业发展提供新路径。本研究中以核桃青果皮为原料制备栲胶，使用响应面法优化栲胶提取工艺，并对其品质进行分析，探讨以核桃青果皮作为原料生产栲胶的可行性，旨在提高核桃副产物的综合利用率，为栲胶产业可持续发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃青果皮：以核桃有50%的青果皮颜色变黄或有1/2开裂为成熟标准进行采收，采收地点为贵州省息烽县西山镇猪场村。

单宁标准品，纯度为98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司。除高岭土为化学纯外，无水乙醇、丙酮、甲醇、磷钼酸、钼酸钠、磷酸、甲酸、浓硫酸、氢氧化钠、氯化钠、铬皮粉等试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MS104TS电子天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；L5S紫外可见分光光度计，购自上海仪电分析仪器有限公司；RJ-TDL-40B离心机，购自无锡市瑞江分析仪器有限公司；HY-852皮革收缩温度测试仪，购自东莞市恒宇仪器有限公司；TMS-Touch质构测定仪，购自美国FTC；RE-52AA旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；DC-1500实验型喷雾干燥机，购自上海达程实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

将新鲜核桃青果皮在70 ℃条件下烘干至水分含量在8%以下，粉碎过80目筛，4 ℃条件下冷藏保存备用。

1.3.2 样品单宁含量测定

准确称取单宁标准品25.0 mg于25 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，混匀，即为1 g/L标准溶液。吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL单宁标准溶液，2.5 mL Folin-Denis试剂和5 mL饱和Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至50 mL，充分混匀，室温静置30 min后，以蒸馏水为空白对照，在650 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，单宁含量为横坐标绘制标准曲线。

采用Folin-Denis比色法[16]测定单宁含量。称取核桃青果皮粉末1.00 g，浸没于提取液中，放入60 ℃水浴锅中提取30 min，然后在4 000 r/min条件下离心8 min，上清液为提取液。吸取1 mL提取液测吸光度，根据标准曲线计算单宁含量（C）。

C=(c×V×n×0.001)/m。

式中：C为单宁含量；c为样品中单宁酸含量；V为提取液总体积；n为稀释倍数；m为样品质量。

1.3.3 样品单宁提取条件筛选

1）单因素试验 基于单宁提取方法，设定单因素试验条件固定液固比（体积质量比）40∶1、提取温度60 ℃、提取时长30 min，分别以蒸馏水、60%丙酮溶液、60%甲醇溶液、60%乙醇溶液为浸提剂进行试验，以单宁含量为评价标准，确定最佳浸提剂，再确定最佳浸提剂的体积分数；设定固定浸提剂为40%乙醇、提取温度60 ℃、提取时长30 min，液固比分别为20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1，确定最佳液固比；设定固定浸提剂为40%乙醇，提取时长30 min，液固比60∶1，提取温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃，确定最佳提取温度；设定固定浸提剂为40%乙醇，提取温度60 ℃，液固比60∶1，提取时长分别 为10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 min，确定最佳提取时长；设定固定浸提剂为40%乙醇，提取时长40 min，液固比60∶1，提取温度60 ℃，分别在酸性（pH 4.0）、中性（pH 7.0）、碱性（pH 12.0）条件下提取单宁，确定最佳pH条件。

2）响应面试验 在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时长4个因素，以单宁含量为响应指标，运用Design-Expert.V8.0.6.1软件程序，根据Central Composite Design试验设计原理，进行响应面试验，具体的因素和水平见表1。

表1 响应面设计因素和水平Table 1 The factor and level of response surface design

1.3.4 样品栲胶品质鉴定

参照文献[18]进行栲胶成分的测定分析。

鞣制效应评价[19]：将50.0 g新鲜猪皮浸没在用甲酸和浓硫酸调节pH为4的6%NaCl溶液中，在60 r/min条件下振荡1 h，然后将获得的浸酸猪皮按照初始质量（增50%）的3%分3次加入核桃青皮栲胶粉，每次间隔20 min后，继续振荡4 h，确保猪皮完全浸没在溶液中，静置过夜，次日振荡1 h后取出皮块，用自来水冲洗表面，取样。参照文献[20]分别测定新鲜猪皮、浸酸猪皮、鞣制猪皮的收缩温度。采用质构测定仪对新鲜猪皮、浸酸猪皮、鞣制猪皮进行弹性、硬度、剪切力的测定[21]。测定弹性和硬度时，仪器参数为检测速度1.0 mm/s、测试后速度5.0 mm/s、形变量30%、触发力0.5 N；测定剪切力时，仪器参数为起始力10 N、下降速度60 mm/min、上升速度120 mm/min。

1.4 数据分析

使用Excel 2007软件进行数据整理及制图，使用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析（Duncan法），使用Design-Expert.V8.0.6.1软件建立响应面回归方程，并对回归方程各项的方差进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素分析

2.1.1 浸提剂对单宁提取效果的影响

浸提剂种类对单宁提取效果的影响如图1所示。由图1可以看出，不同种类的提取剂对单宁的提取效果不同，60%乙醇溶液提取效果最佳，提取液中单宁含量为9.54 mg/g；60%丙酮溶液次之，单宁含量为9.28 mg/g。考虑到丙酮的易制毒特性，选取乙醇作为浸提剂，并进一步研究不同体积分数的乙醇溶液对单宁的提取效果。

图1 浸提剂种类对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.1 Effect of extractant kinds on the extraction of walnut green peel tannin

乙醇溶液的体积分数对单宁提取效果的影响如图2所示。由图2可以看出，随着乙醇体积分数的增加，单宁含量整体呈先升后降的趋势变化，随着乙醇体积分数由20%增加至40%，单宁含量逐渐增加，40%乙醇溶液处理下单宁含量最高（11.69 mg/g）；当乙醇体积分数超过40%，单宁含量反而下降。因此，以40%乙醇溶液为最佳提取液。

图2 乙醇体积分数对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.2 Effect of volume fraction of ethanol on extraction of walnut green peel tannin

2.1.2 液固比对单宁提取效果的影响

液固比对核桃青果皮单宁提取效果的影响如图3所示。由图3可以看出，随着液固比不断增加，单宁含量增大。当液固比达到60∶1时，单宁含量已达到较高水平；当液固比在(20～60)∶1时，单宁含量急剧增加；当液固比高于60∶1时，单宁含量增加较为缓慢。其原因可能是液固比影响单宁的浸出，当液固比较低时，不利于单宁扩散，随着液固比增加，单宁和提取剂充分接触，提取率不再受影响。考虑到节约成本，选取液固比60∶1进行后续试验。

图3 液固比对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.3 Effect of ratio of liquid to material on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.3 提取温度对单宁提取效果的影响

提取温度对核桃青果皮单宁提取效果的影响如图4所示。由图4可以看出，随着提取温度升高，单宁含量不断增加，在提取温度60 ℃时达到最大值11.96 mg/g。当提取温度继续增加，单宁含量呈现下降趋势，可能是因为提取温度高于60 ℃使得单宁发生一定程度的分解，导致单宁含量降低。因此，以60 ℃为最佳提取温度。

图4 提取温度对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.4 提取时长对单宁提取效果的影响

提取时长对核桃青果皮单宁提取效果的影响如图5所示。由图5可以看出，在0～40 min的提取时长范围内，随着提取时长的延长，单宁含量逐渐增加，在提取时长40 min时达到最大值10.86 mg/g；在50～90 min的提取时长范围内，单宁含量基本呈下降趋势；在100～180 min的提取时长范围内，单宁含量处于平缓状态。因为刚开始提取时，物料细胞内溶液与提取液中的单宁浓度差较大，扩散较快，单位时间内单宁释放量较多；随着提取时长的延长，物料细胞内溶液与提取液中的单宁浓度差降低，扩散速度减慢，单宁释放量随之减少并逐渐趋于平缓[22]。因此，以40 min为最佳提取时长。

图5 提取时长对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.5 提取液pH对单宁提取效果的影响

提取液pH对核桃青果皮单宁提取效果的影响如图6所示。由图6可以看出，提取液pH对单宁含量影响较大。在酸性条件（pH 4.0）下单宁含量最高，达到8.08 mg/g；中性条件（pH 7.0）下次之，为7.28 mg/g；碱性条件（pH 12.0）下最低，为6.924 mg/g。表明酸性条件更有利于单宁分子的释放。由于核桃青果皮呈酸性（核桃青果皮与蒸馏水按质量比1∶1的比例混合，pH约为3.88），可满足提取液酸性条件的要求，因此后续试验未对提取液的pH进行调整。

图6 提取液pH对核桃青果皮单宁提取效果的影响Fig.6 Effect of extraction solution pH on the extraction effect of walnut green peel tannin

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面试验方案与结果

在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数（A）、液固比（B）、提取温度（C）和提取时长（D）为自变量，以单宁含量为响应值，设计4因素3水平的响应面试验，对核桃青果皮栲胶提取工艺进行优化。响应面试验方案及结果见表2。

表2 核桃青果皮单宁提取工艺条件响应面试验方案及结果Table 2 Experimental scheme and results of response surface test of the extraction technology conditions of walnut green peel tannin

2.2.2 回归模型方差分析

核桃青果皮单宁提取工艺条件响应面试验结果的方差分析结果见表3，其拟合回归方程为Y=-35.620+0.606A+0.183B+0.517C+0.402D-1.059×10-4AB+1.184×10-3AC-2.899×10-3AD+9.828×10-4BC-1.456×10-3BD+2.333×10-3CD-5.752×10-3A2-1.436×10-3B2-5.501×10-3C2-3.608×10-3D2。

由表3可知，回归模型P值表现极显著，失拟项无显著差异，信噪比为12.02（＞4），表明试验结果与模型拟合度良好，真实误差较小，模型信号较强。且R2为0.94，表明单宁含量有94.05%的变化来自所选的自变量，该模型拟合度良好，该方法具有可行性。该回归模型中，一次项和二次项均有显著性因素，其中A、C、D、A2、B2、C2、D2对响应值均有极显著影响（P＜0.01），4种因素对单宁含量的影响由大到小依次为乙醇体积分数（A）、提取温度（C）、提取时长（D）、液固比（B）。

表3 核桃青果皮单宁提取工艺条件回归模型方差分析结果†Table 3 Analysis of variance results of regression model of walnut green peel tannin extraction technology conditions

2.2.3 响应面分析

响应面曲线梯度反映各因素对单宁含量的影响程度，曲线越陡表示该因素对单宁含量影响越明显[23]。核桃青果皮单宁提取工艺条件响应曲面分析结果如图7所示。由图7可知，A和B曲面比C和D曲面更加弯曲，表明乙醇体积分数分别与液固比和提取温度的交互作用要比提取温度分别与提取时长和液固比的交互作用对单宁含量影响大，与方差分析结果一致。结合方差分析，结果表明乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时长4个因素之间的交互作用不显著（P＞0.05）。

图7 核桃青果皮单宁提取工艺条件的响应曲面Fig.7 Response surface diagram of the extraction conditions of walnut green peel tannin

2.2.4 最佳栲胶制备工艺条件的确定及验证

根据二次线性回归方程的分析结果，核桃青果皮制备栲胶的最佳工艺条件为乙醇体积分数47.51%、液固比61.88∶1、提取温度67.39 ℃、提取时长45.93 min。在此条件下核桃青果皮提取液单宁含量可达到11.125 mg/g。在实际生产中，考虑到操作便易性，将核桃青果皮制备栲胶的最佳工艺条件调整为乙醇体积分数48%、液固比62∶1，提取温度68 ℃、提取时长46 min。采用上述条件，重复3组试验进行验证，核桃青果皮提取液单宁含量为10.98 mg/g，与预测值基本一致，经过离心、抽滤、浓缩、喷雾干燥工艺之后制得的核桃青果皮栲胶得率为26.96%。因此该模型可以较好反映最佳核桃青果皮栲胶制备工艺条件。

2.3 核桃青果皮栲胶品质评价

核桃青果皮栲胶成分分析结果表明，其单宁含量61.75%±2.50%，水分含量5.83%±0.62%，不溶物含量4.75%±0.50%，pH为3.93±0.10，总色值28.25±2.87。以核桃青果皮为原料提取制备的栲胶中单宁含量高于落叶松栲胶[7]中优等品的单宁含量，不溶物含量和pH达到了马占相思栲胶和毛杨梅栲胶一等品的标准[17]，表明利用核桃青果皮生产栲胶具有一定的可行性。但核桃青果皮栲胶单宁含量仍低于橡椀栲胶热溶合格品，且颜色较深，其品质还有待进一步提高。

为了进一步研究核桃青果皮栲胶的鞣制效应，采用新鲜猪皮进行试验，评价鞣制后皮革品质。结果表明，鞣制后的猪皮有所增厚，颜色呈暗棕色，核桃青果皮栲胶鞣制效应分析结果见表4。由表4可知，鞣制后的猪皮比新鲜猪皮收缩温度提高了14.25 ℃，比浸酸猪皮收缩温度提高了21.45 ℃。此外，鞣制猪皮的弹性、硬度和剪切力均显著高于新鲜猪皮和浸酸猪皮（P＜0.05），弹性分别增加了71.67%和58.46%，硬度分别增加了6.17和1.41倍，剪切力分别增加了2.93和1.23倍，表明核桃青果皮栲胶具有较好的鞣制效应。

表4 核桃青果皮栲胶鞣制效应分析结果†Table 4 Tanning action analysis of walnut green peel tannin extract

3 结论与讨论

本试验中以核桃青果皮为原料提取栲胶，通过溶剂浸提法，以单宁含量为评价指标，采用响应面试验设计对提取工艺进行优化，结果表明，乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时长4种影响因素中乙醇体积分数对单宁含量影响最大。在乙醇体积分数48%、液固比62∶1、提取温度68 ℃、提取时长46 min条件下，提取液中单宁含量最大，为10.98 mg/g，与验证结果相近，表明该试验模型结果准确可靠。

与王红等[16]用70%乙醇溶液超声波辅助浸提50 min提取核桃青果皮单宁工艺相比，本试验中所优化工艺条件具有乙醇体积分数低、提取时长短的特点，且提取液中单宁含量高于超声波辅助提取的单宁含量。昝志惠等[24]使用超声波辅助浸提核桃楸中栲胶，成品提取率达到63.68%，但使用了50%的丙酮溶液作为提取剂。与之相比，乙醇易蒸发，后续可回收再利用，可满足工业生产需求，降低生产成本。这与王吉平等[25]的浸提法有相似之处，均体现了绿色高效的特点，同时通过使用浸提法减少了超声波辅助提取造成的栲胶成品中其他非单宁物质对栲胶品质的影响。

单宁是栲胶的主要成分，在植物鞣剂的应用中，栲胶成品的单宁含量是产品是否达到栲胶工业化标准的重要指标[26]。参考周辰[27]的方法，本试验中通过离心、抽滤、浓缩和喷雾干燥工艺制备的核桃青果皮栲胶成品的单宁含量为61.75%±2.50%，不溶物含量为4.75%±0.50%，水分含量不大于10%，pH为3.93±0.10，总色值为28.25±2.87，其单宁含量可达到橡椀栲胶冷溶合格品的标准[8]。鞣制效应是指化学试剂与动物皮发生相互作用后，可以提高胶原的耐湿热稳定性[18]。鞣制剂的鞣制效果对于植物鞣剂的工业化应用具有重要影响。鞣制后皮革收缩温度的升高会增加其柔软度。经核桃青果皮栲胶鞣制后猪皮的收缩温度、弹性、硬度和剪切力均显著高于新鲜猪皮和浸酸猪皮（P＜0.05）。王学川等[28]在使用石榴皮栲胶对绵羊皮进行鞣制时也发现，收缩温度为68.8～75.2 ℃时，复鞣革柔软且具有较大的延伸性和回弹性。因此，核桃青果皮栲胶具有植物鞣剂的性能，可作为新的栲胶原料。使用核桃青果皮栲胶鞣制后猪皮增厚，颜色呈暗棕色，与龚英等[19]使用飞机草鞣制猪皮革的效果一致，推测核桃青果皮栲胶鞣制后猪皮的颜色与总色值相关。这限制了后续栲胶的制革应用，给革制品脱色增加了难度，如何在保证绿色高效提取的同时得到品质较好的栲胶尚需进一步研究。