灌水量对‘赤霞珠’酿酒葡萄根际土壤微生物多样性的影响

沈 甜，牛锐敏，黄小晶，许泽华，陈卫平

（宁夏农林科学院 园艺研究所，宁夏 银川 750002）

水分是农业生产的主要限制因子之一[1-2]，是微生物与周围土壤进行物质交换的媒介，也是控制酿酒葡萄生长和品质的重要因素之一。土壤微生物群落参与土壤中养分的循环与转化，为植物的生长及发育提供能量基础[3-4]。水分胁迫影响植物的光合作用，从而改变根际微生物可利用碳源的质和量，进而间接对根际微生物群落产生影响。植物根系通过自身活动以及向根际释放分泌物来影响根际土壤的养分状况，根际分泌物使得根际微生物繁殖加快和土壤酶活性增强[5-6]。

土壤微生物的生长需要一定的水分活度，降低土壤含水量显著影响微生物物种分布和微生物活性。当土壤干旱时，底物的扩散受到限制，微生物也由于资源不足减缓生化进程[7]。水分含量会直接影响土壤微生物的生理活性[8]。根据联合国政府间气候变化专门委员会（IPCC）的报道，降水率增加或减少20%就会影响土壤微生物的活性和土壤有机质的降解速率[9]。干旱改变土壤微生物群落结构并降低微生物活性[10]。陈铭[11]通过测定干旱条件下和复水后的油茶根际微生物群落多样性得出，土壤体积含水量控制在20%～25%时对土壤微生物群落多样性和丰富度最有利，且干旱复水能够改善油茶根际环境，提高微生物群落的丰富度和多样性。黄旭光等[2]通过研究分析朱槿苗期重度干旱胁迫及复水后根际土壤微生物多样性的变化特征指出，具有促生作用的细菌如酸微菌属Acidimicrobium、厌氧绳菌属Anaerolineaceae等，以及具有一定生防作用的真菌如拟青霉属Pseudallescheria、枝孢霉属Cladosporium等可提高植物在干旱胁迫下对水分的利用率。

宁夏贺兰山东麓地区属于干旱缺水区，年均降雨量不到年均蒸发量的1/10，且该地区多为砂质土壤[12]。采用贺兰山东麓产区的主栽品种‘赤霞珠’Vitis viniferaL.Cabernet Sauvignon酿制的葡萄酒具有口感醇厚、香气浓郁的特点，其栽培面积占该地区酿酒葡萄种植总面积的75%。本研究中以‘赤霞珠’根系微生物为研究对象，采用16S rRNA测序技术及ITS测序技术探究灌水量对其群落多样性的影响，探明灌水量与根际微生物多样性间的关系，旨在为贺兰山东麓地区葡萄园生态系统优化及其影响机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于银川市西夏区芦花台宁夏农林科学院现代农业综合试验基地（106°8′42″～106°8′45″E，38°38′48″～38°38′57″N）。地形平坦，地下水位较浅，土壤属于灌淤潮土，表层沙壤，土壤肥力较高，根系以下土壤质地较黏重，土壤含盐量相对其他小产区较高。葡萄整形采用直立龙干，主蔓倾斜上架，南北行向定植，株行距0.5 m×3.0 m。

1.2 供试材料

供试材料为距18年生‘赤霞珠’葡萄植株主蔓20 cm、50 cm深处的土壤。

1.3 试验设计

2019年，以前期预选最佳灌水方案5 250 m3/hm2为CK，进行‘赤霞珠’灌水试验，灌水方案见表1。萌芽期和埋土期灌水量一致，分别在抽枝期、花前期、果实膨大期、果实转色期进行不同灌水处理。灌水2次是按灌水量分2次平均间隔10 d进行滴灌。埋土期漫灌，其他时期均采用滴灌。滴管布设于离地面50 cm高的葡萄架第1道铁丝上，滴孔间距30 cm，每个滴孔流速是2.1 m3/h。各处理小区面积为353.51 m2，其他田间栽培管理措施一致。

表1 ‘赤霞珠’灌水试验设计Table 1 Experimental design of ‘Cabernet Sauvignon’ irrigation

1.4 样品DNA提取和测序

2019年9月，采用5点采样法进行取样，即主干垂直距离20 cm两边各2个采样点和主干水平线上的1个采样点。

1.4.1 样品DNA提取

使用PowerSoil® DNA Isolation kit试剂盒进行DNA的提取。

1.4.2 样品PCR扩增

细菌16S rDNA全长扩增引物序列：27F（5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′）。真 菌ITS rDNA全长扩增引物序列：ITS9munngs（5′-TACACACCGCCCGTCG-3′）、ITS4ngsUni（5′-CCTSCSCTTANTDATATGC-3′）。

PCR（10 μL）扩增体系：基因组DNA(50.00±0.20) ng，加入细菌16S rDNA全长扩增引物序列27F、1492R或真菌ITS rDNA全长扩增引物ITS9munngs、ITS4ngsUni（均为10 μmol/L）各0.3 μL，加入KOD FX Neo Buffer酶5 μL和dNTP（2 mmol/L）2 μL，加入KOD FX Neo 0.2 μL，用ddH2O补足至10 μL，充分混匀，使用9902型96 well PCR仪进行扩增。

PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反应30个循环；72 ℃延伸7 min。根据电泳结果用ImageJ软件进行定量分析，然后根据每个样品要求的产出数据量及片段大小进行混样，用0.8×的磁珠比例回收纯化。

1.4.3 测序数据质量评估

对原始下机subreads进行校正得到CCS（circular consensus sequencing）序列（SMRT Link 8.0），然后使用lima 1.7.0软件，通过barcode序列识别不同样品的CCS序列并去除嵌合体（UCHIME 8.1），得到高质量的CCS序列，利用第3代测序仪PacBio Sequel 2进行测序。

1.5 数据处理和分析

在相似性97%的水平上对序列进行聚类（USEARCH 10.0），以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU（操作分类单元，operational taxonomic units）。分别选择Silva（Release 132）和Unite（Release 8.1）数据库进行细菌16S rDNA和真菌ITS rDNA物种注释和分类学分析，物种注释采用RDP Classifier算法，置信度阈值为0.8（RDP Classifier 分类器 2.2版）。使用Python语言工具对样品进行层次聚类。使用FAPROTAX软件进行细菌功能基因预测，使用FUNGuild（fungi functional guild）真菌OTU解析工具进行真菌功能基因预测。

使用香农指数曲线来估算群落的多样性。使用Mothur软件和R语言工具依据各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建香农指数曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

式中：H为香农指数，No为实际测量出的OTU数目，ni为含有i条序列的OTU数目，N为所有的序列数。

使用R语言工具绘制主成分分析图，使用SPSS 23.0数据分析软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 灌水量对‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌群落结构的影响

2.1.1 对细菌和真菌群落在门水平上的组成和相对丰度的影响

不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落在门水平上的组成和相对丰度如图1所示，1种颜色代表1个物种，色块长度表示物种所占相对丰度比例，细菌以物种的丰度大于0.1%作为划分依据，共选择了14个优势菌种，真菌选取了在门分类学水平上排名前10的优势菌种。由图1可知，在门水平上，不同灌水处理的‘赤霞珠’根际土壤中细菌相对丰度最大的是变形菌门Proteobacteria，占25%以上，其次是浮霉菌门Planctomycetes、酸杆菌门Acidobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、拟杆菌门Bacteroidetes，丰度排名前10位的还有绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia、硝化螺旋菌门Nitrospirae、装甲菌门Armatimonadetes。T1处理的变形菌门、酸杆菌门的相对丰度明显低于其他处理，拟杆菌门的相对丰度明显高于其他处理；CK的绿弯菌门和放线菌门的相对丰度最低；T1处理的硝化螺旋菌门的相对丰度最低，其次是T3处理，然后是T2处理，CK的硝化螺旋菌门的相对丰度最高，说明减少灌水量一定程度上会降低根际土壤中硝化螺旋菌门的相对丰度，增加绿弯菌门和放线菌门的相对丰度，适度降低灌水量会使变形菌门的相对丰度减少，增加硝化螺旋菌门的相对丰度。

由图1可知，在门水平上，不同灌水处理的根际土壤中真菌相对丰度最高的是子囊菌门Ascomycota，占60%以上，其次是被孢霉门Mortierellomycota、担子菌门Basidiomycota、毛霉菌门Mucoromycota、球囊菌门Glomeromycota、壶菌门Chytridiomycota。减少灌水量明显使‘赤霞珠’根际土壤中子囊菌门的相对丰度降低，明显增加担子菌门和隐真菌门Cryptomycota的相对丰度；毛霉菌门和球囊菌门的相对丰度随着灌水量的减少呈现出先降低、后增加的趋势。壶菌门的相对丰度以T3处理为最高，其次是T1处理，CK的相对丰度最低。T2处理的油壶菌门Olpidiomycota相对丰度明显高于其他处理。

图1 不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落在门水平上的组成和相对丰度Fig.1 Composition and relative abundance of bacterial and fungal communities at phylum level in rhizosphere soils of‘Cabernet Sauvignon’ under different irrigation treatments

2.1.2 对细菌和真菌群落在属水平上的组成和相对丰度的影响

不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落在属水平上的组成和相对丰度及其聚类树如图2所示。由图2可知，CK与T2处理的细菌物种组成较为相似，T1处理与T3处理的细菌物种组成较为相似。不同灌水处理中根际土壤的前10细菌优势菌属依次是MNDI属、浮霉菌属Tepidisphaera、酸杆菌属Vicinamibacter、芽单胞菌属Gemmatimonas、RB41属、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、小梨形菌属Pirellula、Pir4-lineage属、UTCFXI属和黄杆菌属Terrimonas。随着灌水量的减少，酸杆菌属的相对丰度先降低、后增加。减少灌水量会降低黄杆菌属的相对丰度，增加鞘氨醇单胞菌属和UTCFXI属的相对丰度。

由图2可知，CK与T3处理的真菌物种组成相似度最高，T2处理与CK、T3处理的真菌物种组成相似度最低；不同灌水处理中根际土壤的前10真菌优势菌属依次是被孢霉菌属Mortierella、镰刀霉属Fusarium、刺盘孢属Neonectria、毛葡孢属Botryotrichum、毛赤壳属Lasionectria、Dactylonectria、枝孢霉属Cladosporium、四芽枝藻属Tetracladium、念珠菌属Candida、毛壳菌属Chaetomium。减少灌水量会明显降低‘赤霞珠’根际土壤镰刀霉属和四芽枝藻属的相对丰度，增加毛壳菌属的相对丰度。T2处理的被孢霉菌属、刺盘孢属、毛赤壳属、四芽枝藻属的相对丰度最低，念珠菌属仅在T2处理被检测出。

图2 不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落在属水平上的组成和相对丰度及其聚类树Fig.2 Cluster trees of bacteria and fungi in rhizosphere soil of different treatments and cylinder map of species distribution at genus level

不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落组成的主成分分析结果如图3所示。由图3可知，在细菌群落组成中，当第1主成分的累积方差贡献率为35.37%，第2主成分的累积方差贡献率为18.15%时，CK明显离其他3个处理较远，与T2处理的距离最远，细菌群落的相似性最低，其次是与T1处理的距离，T1处理与T3处理有部分重复，其细菌群落的相似性较其他2个处理高，T2处理与T3处理的细菌群落相似性高于与T1处理的细菌群落相似性。

由图3可知，在真菌群落组成中，当第1主成分的累积方差贡献率为42.19%，第2主成分的累积方差贡献率为19.43%时，CK与T3处理的重叠面积最大，其真菌群落的相似性最高，T2处理与T1处理的距离最远，其真菌群落的相似性最低，T2处理与T3处理的真菌群落相似性高于与CK的真菌群落相似性。

图3 不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤细菌和真菌群落组成的主成分分析结果Fig.3 Principal component analysis of bacteria and fungi in rhizosphere soil under different treatments

2.2 灌水量对‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌群落多样性的影响

不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌群落的香农指数曲线如图4所示。由图4可知，随着测序深度的增加，各处理细菌和真菌群落的香农指数曲线趋于平坦，说明测序数据量足够大时，OTU种类不会随测序量增加而增长。

由图4可知，当序列数为500时，各处理细菌群落的香农指数开始出现差异，T2处理的香农指数明显低于其他处理，说明T2处理的OTU种类较少，细菌群落的丰富度低于其他处理，T1处理的香农指数最高，其次是CK。

由图4可知，T2处理的真菌香农指数最高，说明T2处理的OTU种类最多，物种最丰富，且其与T3处理的差异不明显，T1处理的真菌香农指数最低，其次是CK。适度减少灌水量可明显降低‘赤霞珠’根际土壤真菌群落多样性，增加细菌群落多样性；继续减少灌水量时，其真菌群落多样性明显增加，细菌群落多样性明显降低。‘赤霞珠’根际土壤中真菌对水分含量变化的敏感度比细菌高。

图4 不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌群落的香农指数Fig.4 Shannon index of bacteria and fungi communities in rhizosphere soil under different treatments

2.3 灌水量对‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌功能基因的影响

不同灌水处理的‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌功能基因的预测结果如图5所示。由图5可知，T3处理根际土壤中具有化能异养（chemoheterotrophy）功能的细菌的相对丰度最高，其次是T1处理，而T3处理和T1处理根际土壤中具有有氧化学异养（aerobic chemoheterotrophy）功能的细菌的相对丰度高于CK和T2，其中CK最低。T2处理根际土壤中具有硝化作用（nitrification）的细菌的相对丰度最高，其次是CK，T3处理的最低。T2处理根际土壤中具有好氧氨氧化（aerobic ammonia oxidation）功能的细菌的相对丰度最高，T3处理的最低，CK和T1处理的相对丰度差异不大。适度减少灌水量可增加‘赤霞珠’根际土壤中具有好氧氨氧化和硝化作用细菌的相对丰度，过度减少灌水量会显著降低其相对丰度。T3处理根际土壤中具有硝酸还原作用（nitrate redution）功能的细菌的相对丰度最高，其次是T2处理，然后是CK和T1处理。以上5类菌的相对丰度总和达到80%以上。根际土壤中具有好氧亚硝酸盐氧化（aerobic nitrite oxidation）和几丁质分解（chitinolysis）功能的细菌的相对丰度最高的均是CK，表明减少灌水量会在不同程度上减少根际土壤中这2类菌的相对丰度。根际土壤中具有氮呼吸（nitrogen respiration）和尿素分解（ureolysis）功能的细菌的相对丰度以T1处理为最高，适度减少灌水量会增加这2类功能细菌的相对丰度，具有尿素分解功能的细菌的相对丰度随着灌水量的减少呈现先增加、后降低的趋势。

由图5可知，仅T3处理根际土壤中有动物内共生体未定义腐生菌（animal endosymbiont-undefined saprotroph），且其丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal）菌数量最多，其次是CK，T1处理最少；T2处理根际土壤中排泄物腐生菌（dung saprotroph）数量最多，其次是T1处理；T1处理根际土壤中外生菌根（ectomycorrhizal）菌数量最多，随着灌水量减少，数量急剧降低；随着灌水量的减少，体内寄生菌（endophyte）的数量表现出先增加后减少的趋势，叶腐生菌（leaf saprotroph）数量逐渐减少；T1处理和T3处理根际土壤中有少量的兰花菌根菌（orchid mycorrhizal）；T2处理根际土壤中木腐菌（wood saprotroph）数量最多，其次是T1处理，在CK中未检测出。

图5 不同灌水处理中‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌功能基因预测结果Fig.5 Functional gene prediction of bacteria and fungi under different treatments

2.4 灌水量与细菌和真菌门水平物种的相关性分析

选取在门水平相对丰度前15位的细菌物种和在门水平相对丰度前10位的真菌物种与4个灌水量处理进行相关性分析，结果如图6所示。由图6可知，T1处理位于第4象限，CK、T2处理位于第3象限，T3处理位于第2象限，4个处理的细菌和真菌在门水平的物种分布之间差异显著，且灌水量与物种分布和相对丰度具有显著的相关性。T1处理的灌水量与装甲菌门、被孢霉门、异常球菌栖热菌门Dinoceus Thenmes、拟杆菌门的相对丰度显著相关，T2处理的灌水量与油壶菌门、虫霉门Entomophthoromycata的相对丰度显著相关，T3处理的灌水量与球囊菌门、毛霉菌门、隐真菌门、厚壁菌门Firmicutes的相对丰度显著相关。

图6 灌水量与细菌和真菌门水平物种相对丰度的相关性Fig.6 Correlation analysis between different treatments and relative abundance of species at the bacterial and fungal phylum levels

3 结论与讨论

本研究结果表明，灌水量可直接影响‘赤霞珠’根际土壤中细菌和真菌的物种组成，显著影响细菌和真菌的群落多样性，‘赤霞珠’根际土壤中真菌对水分含量变化的敏感度高于细菌。灌水量会直接影响细菌和真菌的功能，适度减少灌水量可增加具有好氧氨氧化和硝化作用细菌的相对丰度，重度减少灌水量可能会提升丛枝菌根的活性。细菌和真菌在门水平上的物种分布与灌水量具有显著的相关性。

水分含量变化引起土壤理化性质及植物对土壤养分利用状况的改变，这些变化均体现在根际微生物上。土壤中细菌群落结构受土壤理化性质的驱动，有机质含量与土壤微生物群落结构之间存在较强的关联性[13]。真菌的生长以及微生物群落均受到水分状况的影响[14-15]，水分胁迫能够增加稻基农田土壤微生物碳含量和土壤微生物熵[16-17]。陈铭[11]采用盆栽控水的方法研究自然干旱条件下油茶根际微生物多样性的变异规律，得出土壤细菌中拟杆菌门、厚壁菌门、Dependentiae及真菌中Eudicotyledonaehe和微球黑粉菌纲与土壤含水量呈显著正相关。本研究结果显示，在门水平上，减少灌水量在一定程度上会降低根际土壤硝化螺旋菌门的相对丰度，增加绿弯菌门和放线菌门的相对丰度，适度降低灌水量会使变形菌门和酸杆菌门的相对丰度减少，会增加拟杆菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度。

球囊菌门属于丛枝菌根真菌，可与大部分植物根系形成菌根共生体，促进植物生长[18]。在水分胁迫条件下，丛枝菌根真菌通过增加渗透调节物质[19]，减少自由基的产生和细胞膜系统损伤[20]，调控水孔蛋白等[21-22]相关基因的方式，改善水分供应和维持能力[23-24]，最终提高植物的抗旱性，促进其生长[25-26]，提高土壤养分利用率[27]。本研究结果表明，减少灌水量明显使‘赤霞珠’根际土壤的子囊菌门相对丰度减少，使担子菌门和隐真菌门相对丰度增加，毛霉菌门和球囊菌门相对丰度随着灌水量的减少呈现出先降低、后增加的趋势。

在微生物群落组成中，不同的微生物类群对水分含量变化的忍耐性或敏感性与其自身的生理特性有关，通常认为，在水分短缺的环境中，细菌比真菌具有更强的忍耐力[28-30]。本试验结果表明，‘赤霞珠’根际土壤中真菌对水分含量变化的敏感度高于细菌，进一步验证了这一结果。另外，水分含量变化会直接影响细菌和真菌的功能，适度减少灌水量可增加具有好氧氨氧化和硝化作用细菌的相对丰度，但是继续重度缺水会直接减少有硝化作用细菌的相对丰度，也会增加动物内共生体未定义腐生菌的相对丰度，随着灌水量的减少叶腐生菌的相对丰度逐渐减少。随着控水力度的增加，外生菌根菌的相对丰度急剧降低。随着灌水量的减少，丛枝菌根的相对丰度呈现出先降低、后增加的趋势，其原因是土壤中含水量降低直接影响丛枝菌根菌的生理活性，但随着缺水程度的加大，可能使得真菌的耐受力增加。

研究灌水量对‘赤霞珠’根际土壤微生物多样性的影响及其相关性，有助于揭示水分对根际土壤微生物结构及活性的影响机制。细菌和真菌在门水平物种相对丰度与4个灌水量处理的相关性分析结果表明，4个处理的根际土壤中细菌和真菌在门水平上的物种分布具有显著差异，且与灌水量具有显著的相关性。其中，T3处理灌水量与球囊菌门相对丰度的相关性显著，重度减少灌水量可有效提高球囊菌门的相对丰度，从而提升‘赤霞珠’的抗旱性。

本研究中仅对灌水量与‘赤霞珠’根际50 cm深度土壤细菌和真菌多样性的相关性进行了研究，未进行不同土层深度土壤微生物的差异研究。另外，植株生长过程中根系分泌物的差异会使根际土壤中微生物多样性发生动态变化。因此，在‘赤霞珠’不同生长时期，开展水分胁迫对根际土壤不同土层深度土壤微生物多样性影响的研究，更能系统阐述水分胁迫与‘赤霞珠’根际土壤微生物的相关性。后续会进一步研究灌淤潮土类型土壤水分胁迫条件下，不同土层深度土壤微生物多样性、根系分泌物、土壤酶活性及理化指标等的差异，详细阐述水分胁迫对土壤微环境的影响，从土壤微环境的角度分析水分胁迫提升葡萄果实品质的机制。