高浓度中药废水降解微生物的筛选及其效果

尚家澄，吴丽红，马思扬，邵 楠

(辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪117002)

近年来，随着人们对天然药物疗效认识程度的提高，中药制药行业得到了迅猛发展，随之大量的中药生产废水需要处理。中药废水有机污染物浓度高，根据中药原材料及生产工艺不同，其废水成分复杂且水质水量变化较大，废水的可生化性较好。目前，我国关于中药废水的处理技术报道得不多，许多研究停留于实验室小试阶段〔1-2〕。

中药废水的基本处理方法分三类：物化法、生物法和物化-生物法〔3〕。用物化法处理中药废水的成本高，劳动强度大，极易引起二次污染，是一种高投入低产出的方法。生物处理方法就是利用微生物的新陈代谢功能，使废水中呈溶解和胶体状态的有机污染物被降解并转化为无害的物质，使废水得以净化。常用的生物处理方法有厌氧生物处理工艺、好氧生物处理工艺、厌氧-好氧工艺和水解(酸化)-好氧工艺等。物化-生物处理法是以生物处理法为主体处理工艺，物化处理法为预处理或后处理的工艺。

在现有污水处理系统基础上结合生物强化技术向废水处理系统中投加功能微生物菌剂，可以进一步提高难降解有机污染物的处理效率〔4-5〕，获得用于投加系统的高效菌种是进行生物强化技术的关键点〔6〕，菌种可以是单一菌种也可以是复合菌种，可以从污水处理系统中筛选获得，也可以外源添加，最终目的是提高系统的污染物处理能力。

为了提高中药废水的处理效果，本试验针对中药废水的特点在传统单一生物处理工艺基础上开发了一体化废水处理装置(水解酸化+接触氧化+BAF)，本试验从稳定运行的处理中药废水的一体化装置水解酸化段和接触氧化段定向分离筛选功能菌，以CODcr为考察指标，通过对CODcr的处理能力考察目的功能菌对高浓度中药废水的降解效果，获得中药废水处理高效菌种，以便为生物强化处理中药废水提供菌源，从而在实际工艺中达到快速启动反应器，缩短污泥适应期，进而在工艺运行过程中获得高效稳定的运行效果。

1 试验方法

1.1 菌种来源

本试验过程中分离筛选菌种来源于稳定运行的中药废水处理一体化处理装置(水解酸化+接触氧化+BAF)的水解酸化段和接触氧化段，该装置水解酸化段是将废水中难降解大分子有机物转化为小分子有机物，利于后续工艺中微生物对有机物的降解与转化；生物接触氧化池属于生物膜法去除系统中的有机物，并具有反硝化脱氮作用；曝气生物滤池(BAF)集生物接触氧化与悬浮物滤床截留功能于一体，可有效去除水中的悬浮物、氨氮、有机物。实际运行过程中，装置对中药废水(1∶1稀释)COD有较好的去除效果，但还达不到直接处理原水(COD在6 000 mg/L～8 000 mg/L范围内)的能力，所以结合生物强化法可以进一步提高系统的污染物去除效果，以达到直接处理原水达标排放的目的。

本试验取一体化处理装置的水解酸化段和接触氧化段活性污泥混合液进行高浓度COD降解功能菌的筛选。

1.2 中药废水原水水质

工艺运行所用的中药废水取自辽宁省本溪市药都某中药厂。原水水质随生产周期有一定的波动性，COD：6 000 mg/L～8 000 mg/L，BOD5：2 500 mg/L～4 000 mg/L，氨氮：20 mg/L～30 mg/L，pH值7～9。COD采用COD快速测定仪测定，BOD5采用五日培养法。

1.3 COD降解菌的分离、纯化与筛选

1.3.1 培养基〔7〕

(1)富集培养基(葡萄糖蛋白胨培养基)：6.0 g葡萄糖，2.0 g蛋白胨，1.0 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸馏水pH值7.2～7.5，121 ℃高压灭菌20 min。

(2)驯化选择培养基：3.0 g(NH4)2SO4，0.5 g Na2HPO4，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，微量元素1 mL，pH值7.2～7.5，1 000 mL水(中药废水比例按梯度驯化逐渐提高，直到与原污水浓度相同为止)，121 ℃高压灭菌20 min。其中微量元素：0.5 g FeSO4·7H2O，0.2 g CaCl2·2H2O，0.15 g MnSO4·7H2O，0.15 g ZnSO4，1 000 mL蒸馏水。

(3)菌种分离培养基：在驯化培养基中加入15 g-20 g琼脂，用中药废水代替蒸馏水，其他条件与驯化选择培养基相同。

驯化培养基与菌种分离培养基中均不外加碳源，碳源完全由中药废水中的有机物提供。

1.3.2 菌种培养

(1)富集培养：分别取水解酸化段和接触氧化段活性污泥混合液5 mL，接入葡萄糖蛋白胨培养基富集培养基的培养瓶中，在30 ℃，120 r/min条件下振荡培养，72 h为一个周期，如此反复富集三个周期。

(2)定向选择驯化培养：将50 mL在1.3.2(1)条件下富集混合菌液接种在1.3.1(2)培养液中，不添加其他外加碳源，以中药废水为唯一碳源进行恒温摇床培养，中药废水初始添加量为培养液的20%，定时取样测定培养液菌浊(A600 nm)的变化情况。培养基明显浑浊后，表明菌种适应中药废水中有机物的种类与浓度，即可将混合菌液转接于新鲜选择培养基中，并逐步增加中药废水的比例，中药废水比例以20%递增，直到中药废水原水浓度相同为止。在驯化过程中，能适应该中药废水环境的菌体得以生存且耐受力逐渐得到加强，成为优势菌，其他菌体则被淘汰。

1.3.3 菌种分离

菌种分离取选择驯化培养时中药废水最高浓度的混合菌培养液作为菌源，用中药废水原水配制的固体选择培养基进行高效有机物降解目的菌种的分离，无菌条件下通过平板划线法反复分离纯化(混合细菌平板培养—单菌落分离、纯化培养)。

1.3.4 菌种筛选

将在1.3.3过程中分离得到的不同纯菌进行扩大培养，然后用高速冷冻离心机进行离心处理，用无菌水将离心物洗出制备不同菌种的纯菌液。纯菌液有效活菌数约为108CFU/mL～109CFU/mL，取等量纯菌液接种到装有200 mL中药废水(测定COD为6 500 mg/L)的培养瓶进行摇床培养，每间隔一定的时间测定培养液COD浓度，根据不同纯菌种对中药废水COD的降解能力筛选高效菌种。

1.3.5 优选菌种的保藏

以无菌接种环挑取筛选得到的单菌落接种到灭菌试管斜面上，30 ℃恒温培养至菌落长出。置冰箱保存备用，用于后续菌种相关特性研究及生物强化扩大培养时使用。

1.3.6 功能菌株相关特性研究

对筛选出的高效菌株进行其单一菌种相关特性研究，进行形态观察及生理生化试验〔7〕。固体培养特征主要考察了菌体形态、菌落形状、菌落隆起形状、菌落边缘形状、菌落颜色、菌落透明程度、菌落黏稠度等。染色实验主要进行了革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色等、生理生化实验进行了需养性试验、葡萄糖发酵实验。

2 结果与讨论

2.1 富集培养

富集培养是在适于目标微生物生长的条件下培养，目标微生物将成为优势种而大量生长从而得到纯培养的一种微生物培养方法。经富集培养后会有大量的目标微生物增殖，但其他非目标微生物也会大量增殖，所以经富集培养后迅速得到浑浊度杂菌培养液。

2.2 梯度选择培养

选择培养具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。中药废水中的高浓度有机污染物会抑制普通微生物的生长，而保留对难降解有机物具有降解或耐受能力的菌种。为了分离出对能够高效降解高浓度有机物的功能菌，通过定向驯化培养增强菌种的降解性能。

在中药废水比例为20%，即COD浓度为1 000 mg/L～1 500 mg/L范围内培养液迅速浑浊，12 h即可观察到培养液明显浑浊，说明在该有机物浓度下菌种生长良好，菌种对该浓度的有机污染物具有良好的降解能力；当中药废水比例为40%，即COD浓度为2 000 mg/L～3 000 mg/L范围内，菌种比上一梯度时生长适应期稍变长，大概经过约20 h后菌浊明显增加，菌种生长良好，说明菌种在适应该有机物浓度范围后也有较好的降解效果；在后续提高中药废水比例的过程中，培养基开始变浑浊的初始时间越来越长，但后期菌种均有一定的生长，表明随中药废水比例的提高，COD浓度升高，能适应高浓度有机物的微生物种类越来越少，菌株生长均受到不同程度的抑制，但在高浓度中药废水中也有相应的菌种适应环境，具有一定的污染物降解能力。本试验过程中，当废水浓度提高到与原中药废水相同，即不需稀释时，经36 h后，菌浊度也有明显提高，表明在该浓度下，微生物能够生存并降解污染物。理论上，此时由于高降解能力和耐受性的菌种种类和数量上均有所减少。

2.3 功能菌分离筛选及其降解效果

在菌种分离固体培养基平板上多次划线，获得19株纯菌，根据菌株外观典型性及对中药废水的去除效果，最终有9株菌具有较强的有机物降解能力，其中从水解酸化段筛选出5株，分别取代号为sj1、sj2、sj3、sj4、sj5；从接触氧化池段筛选出4株，分别取代号为jc1、jc2、jc3、jc4。实验结果如图1、图2。

在中药废水COD浓度均为6 500 mg/L条件下，培养1 d后，各菌株对有机物的去除虽有差异，但均有较好的去除效果，随着培养时间的延长，COD浓度进一步降低，最终9株菌的COD去除率均在85%以上。除sj2、sj5、jc1外，其他5种菌4 d后COD降解基本达到最高，第五天测定结果没有明显变化，最终COD去除率sj1为87.2%、sj3为89.9%、sj4为87.2%、jc2为85.3%、jc3为88%、jc4为87.7%。而菌株sj2、sj5、jc1第5 d对COD仍有很好的去除，最终COD去除率分别为97.8%、96.1%和97.3%，对高浓度中药废水有很强的去除效果。两株水解酸化菌sj2、sj5还有个共同特点，即一天后并不是9株功能菌中降解有机物速度最快的，但降解效果持久，最终COD去除效果好。

可以看出，由于中药废水进水浓度高，虽然功能菌的COD去除率都较高，即便是去除率最高的sj2，COD去除率达到97.8%，但其出水COD值仍达140 mg/L左右。所以在废水处理实际工艺中水解酸化段必须配合其他好氧工艺才能使出水达到排放标准。在本实验实际运行中，一体化处理装置接触氧化段的进水为水解酸化段的出水，进水COD较原水已有明显降低，如果采用生物强化技术将从水解酸化段和接触氧化段分离出的高效功能菌扩大培养后分别应用于一体化处理装置的对应处理段，应具有很好的出水效果，甚至有可能解放曝气生物滤池(BAF)段，这样可以大大减少成本与工艺整体运行时间。

2.4 功能菌形态观察及生理生化试验

对筛选出的9菌株进行了形态观察及生理生化试验，结果见表1。

表1 不同菌株形态特征及其生理生化试验结果

根据实验结果，查阅微生物鉴定手册初步判断筛选到的9株具有高浓度有机物降解性能的菌种8株为细菌，1株为霉菌，具体微生物学类别还需进一步研究后确定。

3 结论

(1)从稳定运行的一体化装置水解酸化段筛选出5株高效COD降解功能菌，接触氧化段筛选出4株高效COD降解功能菌。在进水中药废水COD浓度为6 500 mg/L条件下进行菌种的污染物降解试验，该9株微生物对COD的去除率均在85%以上，其中菌株sj2、sj5、jc1 COD降解率分别约为97.8%、96.1%和97.3%，体现出了很强的高浓度有机物降解能力。

(2)对9株菌株进行了形态观察及生理生化试验，判断8株为细菌，1株为霉菌，说明真菌在高浓度有机物降解中也有很好的去除效果。在后续工作中应进一步通过分子生物学手段鉴定菌种，同时考察优势菌的有机物降解特性，为生物强化处理高浓度中药废水提供参数。

(3)在后续采用生物强化法处理中药废水时，可以按水解酸化段和接触氧化段分别强化运行，不同菌种有针对性地分别投入不同工艺段会有更好的应用性。