酶诱导碳酸钙沉淀（EICP）技术及其在岩土工程中的应用

曹光辉，刘士雨，2*，俞 缙，蔡燕燕，胡 洲，毛坤海

1. 华侨大学 福建省隧道与城市地下空间工程技术研究中心，厦门 361021；2. 华侨大学 福建省智慧基础设施与监测重点实验室，厦门 361021；3. 南昌铁路天河建设有限公司，南昌 330026

1 引言

近年来，微生物岩土技术得到了越来越多的关注，微生物诱导碳酸盐沉淀技术（MICP）是通过产脲酶细菌在土壤中促进尿素水解（Whiffin et al., 2007; Chou et al., 2011; Chu et al., 2014）生成碳酸钙沉淀来改良岩土体，该技术具有替代硅酸盐水泥的前景（Dejong et al., 2013）。MICP技术可以解决诸多的岩土工程问题（刘汉龙等, 2019），例如堤坝的渗流（Ivanov and Chu, 2008; Chu et al., 2014），土壤改良（Dejong et al., 2010, 2013），地基加固（Harkes et al., 2010），扬尘控制（Meyer et al., 2011），土楼保护（刘士雨等, 2020），泥炭土改良（桂跃等, 2020），砂土固化（李昊等, 2020）等。但不可否认的是，MICP仍然面临很多问题，如注浆处理均匀性问题（吴创周等, 2020）；引入外源微生物可能有生物入侵的风险；对于土木工程师来说，进行细菌的培养繁殖有一定难度；另外MICP研究大多是对粗颗粒土壤，对细粒土壤（如粉土或粘土）处理的研究较少，因为粉土、黏土等孔隙较小，细菌可能无法注入，而细粒土在自然环境中广泛存在，微生物胶结可能致使胶结效果不均匀，在以往的研究中，尤其是在大尺度的MICP试验中，发现了相对不均匀的碳酸钙分布（Gomez et al., 2015）。考虑到细菌的主要作用是产生脲酶，若直接采用酶诱导碳酸钙沉淀加固土体，这样可以克服一些MICP的局限性，于是有学者提出酶诱导碳酸钙沉淀技术（EICP）。

在过去几年间，EICP被认为是一种替代微生物诱导碳酸盐岩沉淀的技术，因为没有生物体直接参与该过程，所以EICP被认为是一种仿生物技术。EICP技术为生物岩土领域向前快速发展提供了新的思路和科学依据。EICP是在土壤中混合尿素、氯化钙和脲酶（Nemati and Voordouw, 2003; Yasuhara et al., 2012），尿素在酶的催化作用下水解生成铵根离子和碳酸根离子，铵根离子在溶液中提供碱性环境，碳酸根离子和钙离子结合生成碳酸钙沉淀，以此来加固土壤。脲酶广泛存在于植物（Prakash and Upadhyay, 2003; Barbara Krajewska, 2009; Kumar and Kayastha, 2010)和微生物（细菌，真菌和酵母）（Mirbod et al., 2002; Geweely, 2006）中，目前使用的游离脲酶大多是从植物中提取，包括大豆，刀豆，西瓜籽，豌豆（Kayastha and Das 1999; Das et al., 2002, Dilrukshi et al., 2018; Neda Javadi et al., 2018; Zusfahair et al., 2018）。刀豆（别名杰克豆）是游离脲酶的常见来源。对酶的分子性质进行评估，原生酶的分子量（M）为590000±30000，在变性条件下，脲酶与M分解成相同的亚基，亚基的分子量为96600。天然酶由六个相同的亚基组成，这些亚基以正八面体的形式排列，每个亚基包含一个胱氨酸二硫键和总共15个半胱氨酸残基，且每个亚基单位大小为12 nm，可溶于水，便于在土壤孔隙中传输（Blakely and Zerner, 1984）。植物提取的脲酶在土壤中应用时，脲酶的活性、稳定性和动力学特性随着时间的延长而下降，并且最后会降解消除（Pettit et al., 1976；Marzadori et al., 1998），这从环境友好的角度来说，是有利的。尽管使用市场上纯度高的脲酶价格比较昂贵，但对于工业级应用来说，自制粗脲酶也可以起到不错的效果，且设备简单，价格低廉（Das et al., 2002; Gao et al., 2019）。

目前对环境的要求越来越高，从可持续发展的角度考虑，一些传统的地基加固方法越来越难以满足工程的需求。EICP作为一种环保的新型的岩土技术，会越来越引起公众的重视。EICP处理可采用多种方式，包括注射、表面渗滤、土壤混合和表面喷洒等，可应用于多种土壤改良，例如增强边坡稳定，缓和液化，增强地基承载力，抗侵蚀等（Kavazanjian and Hamdan, 2015; Kavazanjian et al., 2017; Cuccurullo et al., 2020）。通过渗透，喷洒等方式，没有改变土壤结构，不需要对土壤进行混合，更加适合实际应用（Warner, 2004; Bruce et al., 2005）。如果进行灌浆处理，还要考虑到土壤的渗透性和浆液的流动性质（Karol, 2003），渗透性过小，就不能采用灌浆方式处理。土壤侵蚀是岩土工程的一个重要问题，坝体和斜坡容易受到水流的侵蚀作用（Luo et al., 2013; Álvarez-Mozos et al., 2014），需要采取保护措施，采用MICP技术来处理也易受到环境、细菌代谢等方面问题的影响（Montoya, 2012）。与目前的做法相比，EICP作为地基改良方法拥有一些优势，包括没有生物入侵，比较小的环境影响，酶具有降解性等（Hamdan et al., 2013；Kavazanjian and Hamdan, 2015）。因此，采用具有成本效益、环境友好和可持续的EICP技术来控制由水径流引起的土壤侵蚀应是比较可行的。在扬尘控制方面，EICP技术也显示出较强的能力（Bang et al., 2009; Hamdan, 2015; Knorr, 2014）。值得学者注意的是，EICP应用中也会面临低黏度的问题，近似于水，如果进行地表处理还需要去增加黏度（Jose and Hamed, 2018）。

鉴于EICP的研究越来越多，本文对EICP目前的研究进展进行梳理总结，希望推动EICP的深入研究，促进该技术在未来的发展。

2 EICP的机理

酶是由活细胞产生的，对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA，目前已经逐步形成酶学这一学科。按照酶所催化的反应性质的不同，将酶分成六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构物酶类、合成酶类。根据其作用，脲酶显然是一种水解酶。酶的主要共同特征是在其活性位点存在金属中心，其任务是激活底物和水进行反应。在几种金属酶中，尿素酶是独一无二的在活性位点拥有Ni(II)离子的酶（Barbara Krajewska, 2009）。Benini等（1999）、裴迪等（2020）提到包括巴氏芽孢杆菌在内的大多数物种脲酶都包含了ureA、B、C、D、E、F、G等7个及7个以上的基因，巴氏芽孢杆菌的脲酶是典型的三聚体结构，首先由ureA、B、C 基因分别编码脲酶的三种亚基（α、β、γ），并由三种亚基构成αβγ单聚体，3个单聚体再复合形成三聚体(αβγ)3结构，ureD、E、F、G则分别编码了降解尿素所必需的几种辅助蛋白。巴氏芽孢杆菌脲酶三聚体结构如图1所示。

图1 巴氏芽孢杆菌脲酶三聚体Fig. 1 Trimer of Bacillus pasteurii urease（Benini et al., 1999）

不同品种的脲酶活性不同（Hammes et al., 2003; Whiffin, 2004），脲酶催化尿素水解生成碳酸钙沉淀，这个过程需要碱性pH值作为重要的条件，以改变碳酸氢盐平衡形成碳酸根离子。有水存在时，脲酶能将尿素分解为氨和二氧化碳，且脲酶的专一性较强。一般而言，酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能的机制来加快化学反应速度的，一种酶能从成千上万种反应物中找出自己作用的底物，这就是酶的特异性。例如脲酶只能水解尿素，使其分解成二氧化碳和氨。尿素在催化剂脲酶作用下的水解速度非常快，大约是化学(非催化)尿素水解速度的1014倍（Benini et al., 1999），脲酶作用化学方程式如下：（1）~（2）

3 EICP中脲酶的提取方法

3.1 从植物中提取

提取脲酶方法目前是从植物和动物细胞中提取，植物细胞提取主要是从豆类植物种子中获取，主要原因是豆类植物种子中脲酶含量较高，杨凡（2019）采用洋刀豆提取脲酶，方法是洋刀豆先在研磨机上研磨，直至粉碎，再过100目的筛网，得到豆粉，加入纯度为30%的乙醇，摇匀30 min，然后放入4℃冰箱保存24 h，得到一级沉淀，之后两次冷冻离心去上清液得到尿素酶，转速在离心期间设定为8000 r/min，并且做了自制脲酶和订购脲酶的实验效果比较。Gao等（2019）使用从大豆中提取的脲酶液，提取的方法是首先采用干大豆在研磨机上研磨，致使豆粉过滤120目的筛网，使豆粉粒径小于0.15 mm，放入4℃冰箱保存，使用时加入去离子水，并用磁力搅拌器进行搅拌，得到悬浮液，再放入4℃冰箱24 h，之后在离心机上以3000 r/min的转速进行旋转15 min，取上清液即可。Javadi等（2018）用西瓜籽提取脲酶用于改良土壤，先用磷酸缓冲液浸泡西瓜籽，再用搅拌器进行搅拌2 min，用纱布过滤，再离心15 min，上清液通过加入体积分数为20%的预冷却的丙酮，再使用一层厚厚的玻璃棉过滤来去除过多的脂肪层，得到粗脲酶液。最后，通过加入丙酮离心纯化得到纯度较高的脲酶液。Zusfahair等（2018）研究从黑眼豌豆（Black-eyed Pea）中分离纯化部分脲酶，并对脲酶进行鉴定。先使黑眼豌豆发芽，用pH=7的磷酸缓冲液提取发芽黑眼豆，离心分离得到尿素酶粗提物。用丙酮在低温（-12℃），浓度为20%、40%、60%和80%的条件下对脲酶粗提物进行进一步分离。蛋白沉淀在转速7000 rpm情况下离心30 min。目前，已有文献脲酶纯化基本采用丙酮分离法。

统计近十年发表在中文核心、ASCE等数据库关于酶诱导碳酸钙沉淀的文献可以得出图2的数据图，脲酶来源约有33%的比例来自于个人从大豆、刀豆、西瓜籽等植物种子提取，而对于商业购买，日本学者主要是从Kishida Chemical日本公司进行购买，美国学者主要是从Sigma Aldrich公司、Fisher Chemical公司进行购买，Fisher Chemical公司主要是制造低活性的Jack Bean脲酶，Sigma Aldrich公司主要是制造高活性的Jack Bean脲酶，国内也有公司制取脲酶（华中海威（北京）基因科技有限公司）。

图2 脲酶来源（数据来自近十年在中文核心、ASCE等数据库，搜索关键词：EICP、酶诱导碳酸钙）Fig. 2 Source of urease（The data were collected from Chinese core database, ASCE and other databases in the past ten years. Keywords: EICP, enzyme induced calcium carbonate）

3.2 从细菌细胞提取

Hoang等（2020）采用超声裂解法裂解巴氏芽孢杆菌，将150 mL巴氏芽孢杆菌原始菌种直接放入超声浴中进行6轮循环处理，每轮循环是打开超声波10 min，然后关闭冷却10 min，采用循环加工方式，最后裂解液在相对离心力（RCF）5500中离心20 min，从提取的可溶性脲酶中分离出残留的细胞碎片和固体。Jiang等（2020）利用细菌酶（来自巴氏芽孢杆菌）诱导沉淀来减少水蚀影响，其是采用18轮次的声波处理，每轮次持续2 min的声波，停1 min，结束后，悬浮液在20℃，离心力（RCF）8000的情况下，离心5 min，之后上清液再通过0.2 um的过滤器进行过滤，分离蛋白质和完整细胞，将得到的蛋白提取液进行透析以降低氨本底浓度，获得的蛋白质提取物储存在冰箱中，直到进一步使用。Cui等（2020）采用超声波法从细菌中提取脲酶，探讨低pH下单相注入EICP胶结液对土壤的改善。从目前已有文献可以得出，细菌细胞提取脲酶主要是通过细胞裂解的方法，且主要是通过裂解巴氏芽孢杆菌提取细菌。细胞裂解是通过一些外力条件进行，比如化学反应、电解、超声波、渗透压、机械力等；细胞裂解经常用于细胞中成分的提取、纯化，像一些细胞器、细胞酶等结构。一般细菌脲酶的分子量为190~300 KDa，植物脲酶的分子量为480~545 KDa，而典型的细菌细胞，通常有几微米大小，这可以反映出细菌和脲酶处理土壤颗粒大小的程度，脲酶可以处理颗粒更细的土壤。

4 EICP的影响因素研究

酶诱导产生碳酸盐沉淀这一过程受很多因素的影响，脲酶的来源及浓度，反应产物的浓度及配比，反应环境的温度及pH值都会对反应结果产生影响。

4.1 脲酶的影响

Gao等（2019）、杨丰等（2019）通过大豆提取脲酶，利用电导率法测出脲酶活性，得到脲酶活性值和豆粉浓度近似在线性关系上。也可利用吲哚酚法测量脲酶活性（Dilrukshi et al., 2018; Lee et al., 2020），通过铵的生成速率，进而转化为脲酶活性。Lee等（2020）给出了一个大豆脲酶活性的简单转化公式，是由于1mg碾磨黄豆粉的脲酶活性为6.535U，大豆溶液浓度下的脲酶活性可通过公式计算：脲酶活性(U/ml)=6.535(U/mg)×大豆液浓度(mg/mL)，考虑到豆粉的种类批次，反应时的温度不一样等，此公式应该具有一定的局限性，最后得出对于给定的尿素和氯化钙溶液的量浓度，沉淀速率由脲酶溶液的浓度和溶液中脲酶的活性控制。Jiang等（2020）通过细菌裂解的方法配置四种细菌酶溶液（0 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.7 mg/mL, 1.5 mg/mL）用于抗水侵蚀实验，得出酶浓度越高，水侵蚀速率越慢，重量损失率越少的结果。Wen等（2020）做了不同浓度的脲酶和细菌对碳酸钙的沉淀动力学和晶体形态的影响实验研究，通过加入脲酶粉的量控制脲酶浓度，在定量的钙离子情况下（0.25 mol/L），得出脲酶浓度越高，反应速率越快，且反应更可能进行完全。综上，脲酶对EICP结果基本是正向反馈。

4.2 反应物的影响

4.2.1 尿素

Neupane等（2013）做了试管沉淀实验，利用两种浓度0.5 mol/L和1.0 mol/L的尿素和氯化钙，分别与不同浓度的脲酶溶液（0.5~4.0 g/L）混合，24 h后测定碳酸钙总含量，对脲酶浓度与沉淀率关系分析得出，当氯化钙尿素浓度一定时，脲酶浓度越高，沉淀率也越高。若尿素氯化钙浓度偏低时，脲酶有最优含量，可以使沉淀率达到最大值，接近100%，当脲酶浓度再增加时，沉淀率略有下降，猜测这可能是由于过高浓度的脲酶抑制了沉淀反应。实验还得出在脲酶浓度一定的情况下，氯化钙尿素的浓度越低，碳酸钙的沉淀率也就越高，可能是脲酶浓度一定时，高浓度的尿素和氯化钙反而抑制了脲酶的活性。Ahenkorah等（2020）做了EICP的优化实验，探讨了尿素浓度不同，脲酶活性一定的情况下，溶液电导率（EC）的变化，可以看出脲酶活性一定的情况下，尿素浓度越高，尿素水解速率越快，电导率增值也越快，虽然前期电导率变化不是很明显，但后期电导率变化很大。尿素在脲酶的催化作用下，快速水解生成铵根离子和碳酸根离子，脲酶足量的情况下，尿素浓度越高，水解效率越快。

4.2.2 钙源

钙源的种类有很多：氯化钙，硝酸钙、醋酸钙，乳酸钙、工业钙源等，在EICP中目前最常用的是氯化钙，Neupane等（2013）、Almajed（2017）、Dilrukshi等（2018）探讨了氯化钙的浓度的变化对EICP的影响，过高浓度的氯化钙往往可能会抑制脲酶的活性，但随着氯化钙、尿素的浓度增加，一般而言胶结效果更好，获得更大的无侧限抗压强度值。Ahenkorah等（2020）探讨了氯化钙、尿素与脲酶参数的最优配比，以达到胶结的最好效果。尽管氯化钙具有高溶性，但也有局限性，氯离子应用到混凝土中，会对钢筋产生腐蚀作用。在MICP中探究钙源对碳酸钙沉淀和晶型的影响的实验研究较多（Gorospe et al., 2013; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2015），EICP相对较少一些。Phua等（2018）探究了不同钙源对EICP的影响，研究了白垩溶液、氯化钙溶液和乳酸钙溶液对固结试样的晶体实时成核、生长、晶体形态和力学强度的影响，白垩钙源（DCS）是通过将粉状石灰石（白垩）溶解在乳酸溶液中，形成溶解的白垩溶液，过滤掉未溶解物，获得钙源。通过显微镜观测，可以看出在所有溶液中，碳酸钙都发生了快速的沉淀，加入试剂后约10 min后溶液中出现可见晶体，在CaCl2溶液中，大量菱形方解石晶体在初始阶段析出，在前4 h快速增长，之后增长速度减慢到非常低，在剩下的几个小时内几乎保持稳定；在Calact（乳酸钙）和DCS溶液中，成核速度较慢，2 h后结晶率下降，4 h后仍有新晶体出现，生长速率随时间的变化比CaCl2溶液慢，在Calact溶液中形成菱形晶体和球状晶体的混合物，而在DCS溶液中主要是球状晶体，结果表明沉淀碳酸钙晶体的形态与钙源有关。综上，钙源的浓度会对脲酶活性产生影响，高浓度钙离子会抑制脲酶活性；钙源的种类不同，则碳酸钙的晶体形态也会不同。

4.3 反应环境的影响

酶保存条件比较苛刻，要想获得最佳的EICP效果，对反应环境的温度及pH影响的研究必不可少，为了确定最优的温度，Dilrukshi等（2018）检测了温度对脲酶活性的影响，实验所用脲酶由西瓜籽提取，温度变化范围25~70℃，得出脲酶活性最大时温度大约在50℃左右，随着温度的进一步升高，活性迅速下降。Zusfahair等（2018）研究了从黑眼豌豆提取的脲酶的纯化及特性分析，为了确定酶产生最佳活性的温度，对脲酶进行了温度影响试验。使用的温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃（图3a）。从图A的数据可以看出，25℃下的脲酶活性较低。在30℃时，脲酶的活性增加，最大活性在30℃和35℃之间，接下来温度的升高反而降低了脲酶的活性。从图3b的数据可以看出，黑眼豌豆脲酶在pH值为7时的活性最佳。由此可以得出黑眼豌豆脲酶属于中性pH脲酶，且pH对脲酶活性影响影响较大，过酸过碱都会导致酶活性有大的降低。吴林玉等（2020）从大豆中提取脲酶，研究了温度及pH对大豆脲酶活性的影响，得出大豆脲酶最适pH值为8，且在15~75℃范围内，大豆脲酶活性随温度的升高而增大。综上，酶的差异性比较大，每一种酶的最佳pH和温度都不同，即使是同一种酶，在实验条件不同时，得到的酶的活性可能都不同，我们在应用的时候应加以判别。

图3 温度及pH的影响Fig. 3 Effects of temperature and pH （Zusfahair et al., 2018）

温度不仅影响着脲酶的活性，而且对碳酸钙的晶型和形貌也有影响。赵丽娜等（2017）以硝酸铋Bi(NO3)3为添加剂调节碳酸钙晶体的形状和大小，制备了海螺形碳酸钙颗粒。在其它条件不变的前提下，只改变反应温度，分别在20℃，40℃，60℃，80℃下制备碳酸钙。随着反应温度的变化，碳酸钙粒子的晶型也发生了变化，反应温度为20℃时，碳酸钙是典型的球霰石型，40℃时，碳酸钙是球霰和方解石混合型，60℃时，方解石和球霰石混合型，但方解石型主导，80℃时，变为文石晶型。但是需要说明的是，此实验没有脲酶的参与，是CaCl2和NaCO3在Bi(NO3)3等条件下，制备的碳酸钙。

4.4 脱脂奶粉的加入

目前在EICP应用中，大部分都会加入脱脂奶粉（Dakhane et al., 2018; Almajed et al., 2019; Martin et al., 2020; Woolley et al., 2020），Dakhane等（2018）将脱脂奶粉用作稳定剂，因为它有稳定的糖蛋白与酶协调（不是结合），不会干扰酶的活性部位。Almajed等（2019）猜测在EICP处理溶液中加入奶粉可以稳定酶，并可以通过为碳酸盐沉淀提供成核点和降低沉淀速率来促进沉淀（这可能有利于沉淀的形态），于是采用三种不同的EICP处理溶液对土壤进行处理，溶液1称为基线EICP溶液，由1.0 M尿素、0.67 M氯化钙和3 g /L的酶组成；溶液2，即改性后的EICP溶液，由1.0 M尿素、0.67 M氯化钙、3 g/L酶和4 g/L脱脂奶粉组成；溶液3即低浓度改性EICP溶液，由0.37 M尿素、0.25 M氯化钙、0.85 g/L酶和4 g/L脱脂奶粉组成。土壤处理采用渥太华20/30砂，结果出人意料，溶液2相对于溶液1仅仅多加了4 g/L的脱脂奶粉，UCS却有很大的提高，不加脱脂奶粉UCS为145 kPa，而加入的接近1.5 MPa，可见脱脂奶粉的作用比较大。而且比较溶液1和溶液3的结果可以发现，在氯化钙尿素脲酶普遍都处于低浓度的情况下，仅是多加入了脱脂奶粉，其得到的无侧限抗压强度值就提升不止一个数量级。通过SEM观测进行分析，推测含奶粉的处理液试样中析出较大的方解石晶体，可能是由于沉淀速度较慢的原因导致。尿素酶和乳蛋白之间的分子相互作用降低了酶对于尿素的活性，从而降低沉淀率，牛奶中的酪蛋白也可以作为螯合剂，降低沉淀速度。另外在EICP溶液中，酪蛋白可能会沉淀，提供有利于方解石晶体形成和生长的成核位点。当然目前如果想要更详细的去了解奶粉在EICP中的作用，可能需要更多的实验研究。

5 EICP结果检测

5.1 强度检测

EICP处理最常用的是注浆法和渗滤法，实验室级别注浆法采用的较多，因为实验室级别的规模较小，采用注浆法可以让胶结溶液和砂土混合均匀，可以得到更好的实验结果；而考虑到野外实验的条件状况、实际情况，野外实验采用渗滤法的较多。无论室内还是室外实验通常都会对EICP处理过的土壤进行强度检测，作为评价处理效果的一个重要方法。Refaei等（2020）利用无侧限抗压强度试验检测EICP结合海藻酸钠（SA）的试验结果，得出EICP浓度一定时，随着海藻酸钠的增加，其无侧限抗压强度也在增加。强度的增加可以归因于钙离子与来自SA的钠离子交换时形成交联网络，形成凝胶。钙离子能够交联海藻酸盐聚合物是因为它们可以形成两个键，而不是像钠离子只能形成一个键，海藻酸盐与氯化钙溶液接触的时间越长，凝胶就会变得越硬，因为会形成更多的交联，最终会导致硅砂无侧限抗压强度值升高。而且也可以得出当海藻酸钠含量一定时，胶结浓度越高，生成的碳酸钙含量越多，其对应的无侧限抗压强度值也越高。而对于Almajed等（2018）EICP与剑麻纤维（Sisal fibers）结合实验研究，虽然添加剑麻纤维对EICP抗压强度的增量很大，甚至剑麻纤维在最优含量（0.3%）的情况下，其UCS值可以达到不添加纤维的四倍左右，但是可能由于其所用的EICP溶液浓度偏低，导致UCS值偏低，在剑麻纤维最优值的情况下才达到289 kPa，远小于Refaei等（2020）所做的EICP与海藻酸钠结合可以达到的1.8 Mpa。

由于实验所用的固体材料不同，且Almajed等（2018）并没有比较在不同浓度下的EICP的UCS情况，所以无法对海藻酸钠和剑麻纤维的优越性加以比较。杨凡（2019）用EICP做西北土遗址加固，不同溶质浓度，不同滴渗次数下试样单轴强度变化，无论滴渗次数还是溶质浓度的增加都会导致试样单轴抗压强度呈线性增加，而且最大值可以达到1837 kPa，可以看出遗址土通过EICP滴渗加固有较好的固化效果。Zhao等（2014）在文献中描述巴氏芽孢杆菌和脲酶（植物）固化砂的无侧限抗压强度，得出细菌处理后的样品的UCS高于相同脲酶活性下的脲酶处理样品的UCS，脲酶活性为6.0 mM时，细菌固化砂的UCS（约1.79~1.94 MPa）几乎是5倍的脲酶处理样品（约0.33~0.43 MPa）。Hoang等（2020）却得到了不同的结果，与MICP比较，在钙沉淀量相似的情况下，采用BEICP（细菌酶）方法可以获得明显更高的无侧限抗压强度。在2%~4%和5%~8%的碳酸钙水平下，BEICP处理的沙子的UCS大约是MICP处理的两倍。两者结果不同，可能是由于酶的种类差异和处理方法的不同导致的。另外，对于强度检测，还有三轴试验（Gao et al., 2019）和贯穿阻力检测（Martin et al., 2020; Almajed et al., 2020）方法，贯穿阻力检测操作比较简单方便，对不同位置进行针贯试验，也可以比较直观的显示胶结的均匀程度，并与UCS结果可以相互验证。

5.2 碳酸钙含量

碳酸钙的形成是EICP效果的直接表现形式，是该过程的最终产物，对碳酸钙含量的检测就显得尤为重要，因为据此可以分析反应的进行程度、碳酸钙分布的均匀程度等问题。对于EICP中碳酸钙含量的测定，最常用的方法是酸洗法，测定Ca2+浓度通常是采用EDTA滴定法，故用EDTA滴定法也可以侧面反映出碳酸钙的生成量（杨丰等, 2019; 刘阳等, 2019）。Woolley等（2020）、Martin等（2020）用钙测仪进行测量，其中Martin等（2020）使用Eijkelkamp calcimeter检测碳酸钙含量。在这种方法中，土壤与盐酸在一个封闭的系统中混合，可以测量碳酸钙溶解产生的二氧化碳释放所产生的压力。根据校准试验，当时释放的压力与消耗的碳酸钙的质量相关，由此可得出碳酸钙的含量。Dakhane等（2018）在做EICP关于裂缝响应的定量分析时利用碳酸盐解析度对应的峰值，定量分析了碳酸盐的析出量，得出了样品的碳酸钙含量和处理时间的关系。

5.3 微观结构和成分分析

X射线衍射（XRD）是一种生化分析方法，扫描电子显微镜（SEM）则是结合系统中酶诱导生成碳酸盐晶体的虚拟可视化。X射线衍射（XRD）广泛应用于相的定性和定量分析已有60多年的历史。定性XRD分析用于确定样品中的相，而定量XRD分析则确定多相样品中不同相的数量，SEM可以通过对试样放大不同的倍数来观察其形貌，更形象具体。Hamdan等（2015）应用EICP进行土壤加固试验，对胶结砂柱样品做了XRD分析，XRD分析结果如图4所示，证实方解石矿物相是存在于胶结土块体中的，其中标准方解石、石英显示在中图和底图。

图4 胶结砂样的XRD结果（上图），方解石、石英分别显示在中、底部图中Fig. 4 XRD results from a cemented sand sample (top plot). Calcite and quartz are shown in the middle & bottom plots, respectively（Hamdan, 2015）

Wen等（2020）用SEM展示了细菌和脲酶产生的沉淀的晶型差异，细菌诱导产生的碳酸钙晶型主要是球霰石型，脲酶诱导产生的碳酸钙晶型主要是方解石型。图5为不同浓度的细菌溶液在不同反应时间下的SEM图像，可以看出在12 h时，所有细菌浓度都生成了球粒状的晶体，并且随着时间的延长，晶体也在生长，致密性在加大。而对于高浓度的细菌，12 h的沉淀晶体的SEM图像比低浓度的致密，且在后期形成了具有纹状表面的大棱柱状晶体，表明该晶体为球霰石和方解石相构成。图6为不同浓度的脲酶溶液在不同反应时间下的SEM图像，当脲酶浓度偏低时（1.0 g/L），在12 h观察到表面隆起的小晶体，在晶体表面似乎出现了一些球晶，晶体相随时间变化不明显。在高浓度脲酶（8.0 g/L）下，开始形成了方解石相，在脲酶浓度处于中下时，随着时间的延长，可以看出球晶逐渐消失，最后变成方解石相。总体而言，在脲酶诱导体系中，碳酸钙晶体主要由方解石相组成。

图5 不同细菌浓度下碳酸钙晶体的SEM图像(A: OD 600 = 0.1, B: OD 600 = 0.3, C: OD 600 = 0.6, D: OD 600 = 1.0)Fig. 5 SEM images of calcium carbonate crystals at different bacterial concentrations (A: OD 600 = 0.1, B: OD 600 = 0.3, C: OD 600 = 0.6, D: OD 600 = 1.0; Wen et al., 2020）

图6 不同脲酶浓度下碳酸钙晶体的SEM图像（A’urease 1.0 g/L, B’urease 2.5 g/L, C’urease 5.0 g/L, D’urease 8.0 g/L）Fig. 6 SEM images of calcium carbonate crystals at different urease concentrations (Aurease 1.0 g/L, B’urease 2.5 g/L, C’urease 5.0 g/L, D’urease 8.0 g/L; Wen et al., 2020)

6 EICP的应用

目前在EICP中应用较多的是进行砂土方面的研究，尤其是在砂土防风蚀方面，过去人们已经开发了多种技术来控制风蚀，包括润湿土壤和在土壤表面施用盐、海水或合成聚乙二醇来增加土壤的凝聚力。但是在干旱和半干旱环境中，用水作为一种防尘方法受到限制，因为水蒸发较快且干旱地区一般缺水，而使用海水控制扬尘会产生对植被、地下水、道路、设备和车辆等的不利影响。在过去的二十年里，生物技术作为传统方法的替代品被积极地研究，EICP技术进行土壤处理可以构成一个可持续的方法用来替代传统的风蚀缓解技术。通过在土壤表面喷洒EICP溶液，在氯化钙等钙源存在的情况下，利用游离尿素酶催化尿素的水解，迅速生成碳酸钙，钙盐在土壤孔隙中形成，有助于将土壤颗粒结合在一起，从而提高处理后土壤的岩土力学性能。国内，吴林玉等（2020）研究了植物酶在固化砂土方面的试验研究，他们从大豆中提取脲酶，研究了温度及pH对大豆脲酶活性的影响，然后进行了诱导碳酸钙沉淀试验，用超声波检测，无侧限抗压强度测试等实验检测效果。Gao等（2019）采用大豆酶诱导碳酸钙沉淀的方式来加固粉质土壤，实验结果表明粉质土没有出现淤塞的现象，强度得到较大提升；杨凡（2019）从洋刀豆中提取脲酶加固西北地区的遗址土，实验结果表明遗址土的强度、耐久性、抗冻等性能都有提高，证明了EICP用来加固遗址土的有效性。蒋耀东等（2017）利用脲酶诱导碳酸钙沉淀研制新型环保的扬尘抑制剂，确定了脲酶抑尘剂的最佳成分配比为脲酶30 g/L，尿素0.8 mol/L，氯化钙0.8 mol/L，高分子吸水树脂1 g/L。其测试性能显示抗蒸发性、保水性、抗风性、抑尘效率都优于其它的几种抑尘剂。

国外关于EICP的应用研究较多，在防风固沙，扬尘治理，加强软弱地基，加固边坡，土钉墙，裂缝修补等很多方面进行研究。Kavazanjian等（2015）利用两种不同级别的硅砂来进行砂柱实验，证明了利用EICP胶结砂柱进行土壤改良的可行性，其结果显示砂柱的抗压强度可以超过500 kPa。Ossai等（2020）评估了使用EICP控制坡耕地沙土径流侵蚀的可行性。Dakhane等（2018）进行了植物源脲酶催化尿素水解反应进行砂浆裂缝愈合实验，先预制混凝土裂缝，加入EICP溶液进行修复，采用一系列数字图像技术生动形象的展示了裂缝的修复情况，证实了EICP在裂缝修复方面的可行性，且具有明显的优势。也有学者在EICP中采用化学计量模型进行预测，O’Donnell等（2016）建立了一种化学计量模型，用于预测两种不同的生物土工改良土壤技术（酶催化尿素水解和微生物反硝化）的碳酸盐沉淀量和气体产量，根据实验室测试数据进行了校准，这将有助于实施具有成本效益、非入侵式的和可持续的地面改善。这种批次反应器（无流动条件）的数学模型，是分析大型生物岩土地基改良工程的比较重要的一步。Nafisi等（2019）得出了在不同粒径（三种类型的砂）、不同胶结程度（未胶结、轻、中、重）的情况下生物胶结砂的抗剪强度包络线。Yasuhara等（2012）预测了EICP胶结砂土后的导水率和孔隙度物理特性的变化，其UCS值可达到400 kpa到1.6 MPa，在透水性能方面改进后的样品的渗透率降低了一个数量级以上。

Kavazanjian等（2017）做了大尺寸的EICP试验，用于基础支撑和土钉支护，柱状胶结实验在6个5加仑（≈19 L）桶中进行，3桶干燥土壤和3桶注水土壤，在EICP溶液全部注入后，这些桶用保鲜膜包裹，放置26 d。结果显示，干桶中岩土体（桶1~3）在注射管周围胶结不连续，而在注射管上附着胶结效果较好的连续的环状形胶结，如图7a。湿桶（桶4~6）中的胶结土壤以球状形式附着在注入管上，如图7b。除去事故原因没有测试的2#桶，剩余五个样品的无侧限抗压强度值是从64 kPa到125 kPa。垂直柱胶结试验也在大约1.3 m的木箱中进行，箱置于内衬二次容器中，灌装自来水约230 L，在箱子里装上约1000公斤的原生土壤。先向注射管中加入约33 L的EICP溶液，14 d后第二次注射EICP溶液40 L，数天后结果显示，土壤大致呈现出鞍状、轻度胶结的柱状形态，见图7C。结果表明，EICP有希望作为一种地基改进技术，在无粘性土壤中创造稳定的垂直柱和土钉。

图7 a，b：19 L桶测试 c：1 m3土箱拆卸后的土Fig. 7 a and b: 19 L drum test; c: 1 m3 of soil after disassembly of soil box （Kavazanjian et al., 2017）

Jiang等（2020）利用细菌酶诱导产生沉淀来减少水侵蚀，通过自提取的细菌酶，注浆技术通过喷洒方式应用于粉砂土试样表面。利用四种不同浓度的酶溶液（0-对照、0.3 mg/mL、0.7 mg/mL和1.5 mg/mL）处理标本，在水流速度23.2 cm/s下，测定其抗侵蚀性（图8）。通过样品重量损失来评价抗侵蚀性，结果表明，高浓度酶处理的样本，重量损失率几乎为零，而对于低浓度酶处理的样本，浓度越低则重量损失率越严重，最高损失达到44 g，损失率是15.5%。本研究的结果表明，BEICP技术通过在材料表面喷施，有可能成为减少砂土侵蚀的有效解决方案。

图8 水槽实验Fig. 8 Flume experiment （Jiang et al., 2020）

Martin等（2020）在一个0.6 m×0.6 m×1.2 m的模型箱中采用EICP技术胶结了一个直径为0.3 m，长度为0.9 m的砂柱，砂柱的尺寸小于模型箱，是因为注浆管的特性所致，且砂柱尺寸跟目标尺寸直径误差在10%之内，长度比预期增加20%，长度的增加可能是灌入过多的处理液所致。通过贯入度试验表明，砂柱的无侧限抗压强度值可以达到500 kPa。但下部的无侧限抗压强度值偏低，平均为150 kPa，可能是由于注射的胶结液分布不均匀所致。结果表明EICP可作为地基加固技术，可以减少松散砂体的沉降，图9是胶结砂柱示意图。

图9 大规模胶结砂柱示意图Fig. 9 Schematic diagram showing large-scale cemented sand column

缪林昌等（2019）进行了EICP与聚丙烯酰胺（PAM）的协同作用的现场试验研究，测试地点位于腾格里沙漠，距离中国宁夏中卫市30公里。四种固化沙漠工艺总占地面积200 m2，分为A、B、C、D四个试验区（图10），A区是0.5 mol/L的EICP混合液，B区是0.5 mol/L的EICP混合液+0.6 g/L的PAM，C区是0.75 mol/L的EICP混合液，D区0.75 mol/L的EICP混合液+0.6 g/L的PAM，每个试验区宽5 m，长10 m，每两个试验区之间有间隙1 m，起到分割和空白对照作用，每个试验区喷洒EICP混合溶液100 L。实验结果得出7天左右固化基本完成，硬度值都能超过300 kPa，接近原始沙漠的20倍。同浓度的EICP混合液中，EICP+PAM的硬度值高于EICP 6%~7%。现场试验表明，EICP是一种较好的固化沙漠沙的方法，可用来治理风沙灾害。

图10 腾格里沙漠现场实验区域Fig. 10 Field experimental area of the Tengger Desert （Miao et al., 2019）

Hamdan等（2016）使用黄原胶（Xanthan gum)、瓜尔胶生物聚合物(Guar gum)及多元纤维素（Polyolcellulose）水凝胶来评估通过保留土壤颗粒周围的反应产物来增强EICP的能力，对实验中使用的三种水凝胶的保水性进行了理论评价，并通过实验室实验进行了验证。从结果可以看出，在所有的水凝胶辅助EICP测试中都出现了尿素溶解和碳酸钙沉淀，这表明该研究中使用的水凝胶不会干扰EICP。此外，水凝胶辅助的EICP可以在较长时间内保持水分，降低EICP溶液对土壤的渗透，延长反应时间，提高沉淀效率，并促进结壳的形成。?

7 EICP面对的问题及挑战

7.1 EICP成核位点的缺失

微生物诱导产生碳酸盐沉淀（MICP）中，以巴氏芽孢杆菌为例，巴氏芽孢杆菌能够诱导碳酸盐沉淀，主要是由于其两大特征，一是巴氏芽孢杆菌能够分泌高活性的脲酶，脲酶催化周围的尿素水解，迅速提高周围环境的碳酸根离子浓度和铵根离子浓度；二是有研究证明，巴氏芽孢杆菌菌面（包括细胞壁、胞外聚合物）带有更多的负电荷，对阳离子有更强的吸附作用，于是带有正电的Ca2+被大量吸附于巴氏芽孢杆菌表面，在碳酸根离子和碱性条件下，就会以细胞为核心，生成碳酸钙沉淀。直接以酶进行诱导就会缺少细胞这种结晶核，缺乏成核位点，可能导致碳酸钙沉淀形态紊乱。目前已经很多学者在尝试解决这个问题，比如引进成核位点，或者土壤中的一些细小的颗粒可能作为成核位点。 Khodadadi等（2017）提到矿物学的沉淀中方解石晶体是碳酸钙最稳定的矿物相，与其他碳酸钙矿物形式的沉淀相比，方解石晶体的耐久性更好。在EICP中，高的析出率和缺乏成核位点促进了CaCO3的非晶态和亚稳态的形成，这些非晶态和亚稳态的溶解度高于菱形方解石。降低沉淀速度，采用适当的固化方法，提供成核位置，例如通过向土壤中引入碳酸钙“种子”作为成核位点，改善析出物的形态。目前研究发现有的细菌虽然没有产脲酶的功能，但是却能起到成核位点的作用（Wei et al., 2020）。

7.2 EICP中酶的问题

尽管纯化脲酶在市场上比较容易获得，但其价格高昂，用在工业级上显然不经济，自制脲酶价格低廉，以大豆制取脲酶为例，大豆价格便宜，制取脲酶液步骤也比较简单，制取的脲酶液可以满足实验室级别和工业级别的需求。Cuccurullo等（2020）认为酶比较娇贵，要注意保存，粗大豆提取物的样品暴露在实验室的空气中（温度25℃，相对湿度40%左右），持续72 h后，脲酶基本失活，而且提取物在数小时后pH呈现下降，新鲜大豆的提取液才能更有效的催化尿素的水解。此外，Miao等（2019）也提到尽管EICP在短期内处理风沙侵蚀的效果比较好，但是其长期的效果没有进行检验，需要进一步的验证。因此，为了保证脲酶的活性和稳定性，脲酶需要在低温密封条件下保存，否则容易引起脲酶失活变质，且由脲酶活性在温度不是过高时，一般具有随温度的升高而升高的特性可知（Dilrukshi et al., 2018; 吴林玉等, 2020），在应用时为了提高脲酶的活性，可选择在环境温度相对较高的条件下进行。

7.3 EICP对环境造成的影响

无论是EICP还是MICP，不可否认的是都会面临氯化铵（NH4Cl）副产物的干扰，NH4Cl作为一种公认的地下水污染物，致使EICP技术不处理掉氯化铵，在城市大规模应用是不可能的。目前也有不少的方法在尝试解决污染问题，Zhao等（2016）开发了一种新的方法，在土壤基质上合成超支化仿生水凝胶（Biomimetic hydrogel）网络，以提高松散土壤的机械强度，同时减轻过量铵可能造成的污染。PAA（聚丙烯酸）联合EICP有较多优势，包括延长水供应的时间，去除有害的副产品铵，实现较高的土壤强度。胶结的土壤外壳可承受4.8×103kPa的压力，氨的去除率达到96%。这些结果证明了水凝胶联合EICP在防治风蚀、减缓副产品铵的污染方面起到好的效果。图11是仿生水凝胶作用的示意图。

图11 仿生水凝胶Fig. 11 Biomimetic hydrogels （Zhao et al., 2016）

Martin等（2020）对EICP做了环境影响评估，目的是评估EICP环境效益和成本，并尽力识别EICP过程中可能出现的潜在的后果。主要考虑了几种主要的成分（尿素、钙，脲酶，脱脂奶粉），结果表明，尿素占能源消耗的63%、CO2空气排放量的37%，脱脂奶粉占CO2空气排放量的38%，EICP过程的副产物铵对EICP富营养化潜力的贡献率为97%。减少这些影响的方法，包括寻找更环保的尿素来源、使用废牛奶作为脱脂奶粉的来源、以及在完成EICP处理后从地下提取氯化铵。

7.4 EICP与数字模拟技术的结合

应用于土木工程的数值分析计算软件有很多，例如常见的ANSYS、MIDAS、MATLAB、FLAC3D、ABAQUS等软件，很受欢迎。尽管大型计算机建立的数学分析模型越来越贴合实际，分析精度越来越高，但不可否认的是由于各种原因导致生物岩土在数值软件方面发展缓慢。Yasuhara等（2012）通过一套计算方法和数学公式，对EICP胶结后的样品进行导水率及孔隙变化的预测，模拟EICP过程中的平流—扩散传播过程的数值分析，并加以考虑钙质沉淀动力学的化学反应，预测渗透率的变化。预测结果显示，与实际测量值进行比较明显高估了渗透率的值，但与测量到的孔隙度变化吻合较好。Dakhane等（2018）在利用EICP进行裂缝修补时，基于裂缝结构运用数字图像相关技术进行了定量分析，数字图像相关是一种非接触光学方法，利用在机械测试期间不同时间拍摄的数字图像提供样品的全场表面位移。横梁表面被随机的布上斑点，可以提供与图像相关的足够的对比效果（图12a），电荷耦合器件（CCD）照相机在测试期间每5秒记录一次图像，一个大约120 mm×60 mm的矩形区域在切口上方处成像（图12b）。测试结束后，使用VIC-2D软件，对数字图像进行后处理。对应于不同位置的图像子集之间的相关性确定CMOD图，计算位移区域变化。图13分别显示了从DIC获得的用于control和LC-14砂浆试件的二维（2D）位移场和砂浆水平位移的三维（3D）表面图。

图12 (a) CMOD控制模式下缺口梁三点弯曲试验装置; (b) 峰前区域DIC的水平(u)位移场Fig. 12 (a) Three-point bending test device for notched beam under the CMOD control mode; (b) The horizontal (u) displacement field of DIC in the pre-peak region （Dakhane et al., 2018）

图13 (a) 和 (b) 二维水平 (u) 位移场; (c) 和 (d) 位移场三维图Fig. 13 (a) and (b) 2D horizontal (u) displacement field ; (c) and (d) 3D displacement field diagrams （Dakhane et al., 2018）

综上，数值模拟技术与EICP结合，应用前景广阔，应用背景也比较契合，但是考虑到自然土壤的复杂性，不确定性，多样性，土壤的各种物理、化学和生物特性可能会影响脲酶的活性，还有软件开发的难度，生物岩土领域研究的不够深入，这些问题都给参数的设置，模型的建立等，提供比较大的难度。

7.5 EICP加固均匀性

岩土处理的均匀性至关重要，总结文献得出，EICP用于岩土加固的均匀性，受较多因素的影响，尤其是注浆方式影响较大（Kavazanjian et al., 2017; Martin et al., 2020），注浆液分布不均，导致生成的碳酸钙分布不均，各处的UCS值不同。Paassen等（2010）、Yasuhara等（2012）给出了UCS和碳酸钙沉淀的数据关系图，得出当能很好的控制碳酸钙的产量时，加固体的UCS及渗透率也就能得到控制，但这还需要进一步的试验研究。从EICP机理上来说，酶相对于细菌具有更小的尺寸，可以到达细菌无法到达的区域（Almajed, 2017; Gao et al., 2019），因此在加固细颗粒土时其均匀性相较于MICP有优势。

8 结论

本文从EICP机理、脲酶的制取方法、EICP的影响因素、检测方法、应用等方面展示了EICP的研究进展，阐述了EICP在地基基础加固，提高砂土强度，裂缝修复，防水侵蚀，防止风沙灾害，扬尘治理等众多岩土领域的应用，显示EICP在不久的将来可以突破传统方法的局限性，作为一种可持续的、较环保的、多功能性的技术大范围应用于工程实践。然而，从实际来看，EICP应用于工程中仍然要克服许多挑战： （1）工程现场条件的复杂性、不确定性；（2）EICP应用中成核位点的缺失，难以保证胶结的质量和均匀程度；（3）氯化铵副产物的污染问题。总的来说，我们目前还需要进行大量的实验，研究在现场使用EICP的最佳方法，以求达到最好的效果。报告最后显示未来EICP也会面临信息化施工的可能性，我们应在这方面多做工作，以期更好的推动EICP的进步。