沉默DNMT1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖侵袭影响

张羽森,张瑱,韩兆峰

(1 郑州人民医院整形美容外科,河南 郑州 450000；2 郑州大学第一附属医院整形美容外科)

皮肤损伤后成纤维细胞等修复细胞增殖加速和细胞外基质(ECM)大量合成是瘢痕疙瘩的病理学基础，但目前其发病原因及机制尚未完全明确[1]。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是DNA甲基化过程中的一个重要分子。而DNA甲基化酶催化基因甲基化后可抑制基因转录及复制，导致基因相关的平衡失调，最终导致疾病发生[2]。DNMT1与纤维化及增生存在密切关系，尤其是细胞增殖和癌细胞存活[3]。但DNMT1与瘢痕疙瘩相关性研究尚未见报道。已有研究显示，瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)中DNMT1蛋白阳性表达率明显高于正常皮肤成纤维细胞，甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可诱导体外培养的KFB凋亡，并抑制成纤维细胞因子DNMT1和TGF-β1表达，上调Smad7表达[4]。提示抑制基因甲基化有可能成为瘢痕疙瘩防治的新方法。因此，本文探讨沉默DNMT1表达对KFB增殖及侵袭能力影响，为该病治疗提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1标本来源 瘢痕疙瘩标本取自2016年5月—2017年10月郑州人民医院整形美容外科手术切除病灶，共9例，取自前胸部3例，耳垂部5例，上臂1例。选择标准：病人无瘢痕疙瘩感染破溃及治疗史，无免疫抑制剂、糖皮质激素等用药史，无全身系统性疾病。样本采集均符合手术标准，病人均签订知情同意书，并得到医院伦理委员会批准。

1.1.2试剂和仪器 RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素均购自美国Gibco；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce；CCK8溶液购自上海碧云天公司；Transwell细胞培养板及Matrigel胶均购自美国BD；DNMT1、β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体均购自美国CST；酶标仪购自美国BIORAD。

1.2 实验方法

1.2.1KFB的培养 无菌条件下切取瘢痕疙瘩病人的病变组织。瘢痕疙瘩组织均经病理检查而明确诊断。采用组织贴壁法原代培养KFB，即将组织剪成2 cm×2 cm大小，浸泡在含青霉素-链霉素的生理盐水无菌盒中，用手术刀将组织块削成厚度为1 mm左右的薄片，再剪成3 mm×3 mm大小组织块。用枪镊按照0.5～1.0 cm间距将组织平铺在50 mL的无菌培养瓶中，向瓶中加入约0.5 mL的RPMI 1640培养液，缓慢翻转培养瓶，底部朝上，放入含体积分数0.05 CO2、90%湿度、37 ℃培养箱中培养。4 h后加入含体积分数0.10 FBS及双抗的RPMI 1640培养液，翻转培养瓶，以使培养液能恰好覆盖组织块，于培养箱中继续培养。每2 d换液1次，倒置显微镜下观察KFB长满瓶底后，胰蛋白酶消化、培养液终止消化，接种至新的培养瓶。经3～4次传代，收集对数期细胞用于实验研究。

1.2.2细胞转染方法[5]根据Gen Bank中提供的人DNMT1基因序列以及siRNA原则，设计针对DNMT1的特异性siRNA序列，同时提供随机序列作为阴性对照siRNA，序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。实验分为空白组、阴性对照组(阴性组)和DNMT1-siRNA组(实验组)。取生长状态良好的第4代KFB接种于6孔板，培养箱常规培养，当达30%～50%汇合度时，阴性组和实验组将依据脂质体制备的siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入至6孔板，空白组加脂质体，置于含体积分数0.05 CO2、37 ℃培养箱孵育4 h，换成细胞生长培养基继续培养。48 h后，应用Western blotting检测各组细胞DNMT1的蛋白表达。

1.2.3转染效果和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测[6]以适量细胞裂解液提取转染siRNA后的细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。DNMT1稀释比为1∶500，内参照GAPDH稀释比为1∶1 000，加HRP标记的二抗稀释比为1∶3 000，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜，加ECL化学发光试剂，在暗室室温下温育5 min，X线胶片曝光、显影、定影。同法检测β-catenin、c-myc、MMP-2和PCNA蛋白的表达。

1.2.4细胞增殖能力检测[7]以3×107/L细胞密度接种生长状态良好的4代KFB于96孔板，每孔100 μL，孵育24 h后按照上述分组转染siRNA，同时设置空白组，每组设置5个复孔。分别在转染的24、48、72和96 h取出96孔板，加CCK8试剂(每孔10 μL)。实验重复3次。

1.2.5细胞侵袭能力检测[8]将40 μL的 Matrigel(用预冷无血清培养基以1∶3比例稀释)加入到预冷的Transwell小室中，37 ℃孵育2 h以使胶凝固。上室中加入转染siRNA 48 h的细胞，下室中加入600 μL的完全培养基，用结晶紫染色10 min，倒置显微镜(400倍)随机选择5个视野，计数穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 DNMT1在转染DNMT1-siRNA的KFB表达

DNMT1-siRNA转染KFB后 48 h，Western blotting检测DNMT1蛋白表达结果显示，空白组、阴性组和实验组的表达量分别为0.679±0.059、0.679±0.059和0.087±0.012，实验组DNMT1表达明显低于空白组(F=139.156，P<0.05)，而阴性组DNMT1表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 DNMT1在转染DNMT1-siRNA的KFB表达

2.2 沉默DNMT1表达对KFB活力的影响

CCK8方法检测沉默DNMT1对KFB活力影响的结果见表1。析因设计方差分析结果显示，不同时间、组间及其二者交互作用下KFB活力差异均有统计学意义(F组间=1 197.182，F时间=1 380.040，F交互=19.115，P均<0.001)。实验组的KFB活力在24～96 h均显著低于空白组，差异均有统计学意义(F组内=45.688～57.141，F组间=15.037～28.811，P均<0.05)。

表1 沉默DNMT1表达不同转染时间对KFB活力的影响

2.3 沉默DNMT1表达对KFB侵袭能力的影响

Transwell小室检测沉默DNMT1后KFB侵袭能力的结果显示，空白组、阴性组和实验组的穿膜细胞数分别为176.7±9.2、172.8±8.5和91.2±4.6，实验组细胞侵袭能力显著低于空白组，差异有统计学意义(F=117.810，P<0.05)。

2.4 沉默DNMT1表达对KFB 的Wnt/β-catenin信号通路影响

Western blotting检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin和c-myc及下游PCNA和MMP-2的蛋白表达结果显示，与空白组比较，实验组β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2的蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(F=34.926～103.743，P<0.05)。见图2和表2。

表2 各组β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2蛋白相对表达量比较

图2 沉默DNMT1表达对KFB 的Wnt/β-catenin信号通路影响

3 讨 论

DNA甲基化是表观遗传学的重要分支，其在调节机体生命活动过程中作用显著，机体内DNA异常甲基化，可伴随DNMTs异常表达[9]。DNMT1是从真核生物中第一个克隆出来的DNMTs，主要功能是维持DNA复制后的甲基化状态[10]。已有多项研究表明，DNMT1在肿瘤发生、胚胎发育、细胞衰老等过程中起重要作用[11-13]。瘢痕疙瘩是伤口愈合及修复过程中以KFB过度增殖及ECM大量沉积为特点的体表纤维化疾病。已有研究结果表明，DNMT1表达水平与瘢痕疙瘩生长呈负相关，同时越靠近边缘区域的瘢痕疙瘩组织的DNMT1表达越高[14]。这提示DNMT1与瘢痕疙瘩的进行性生长及浸润生长存在密切关系。而DNMT1表达上调提示KFB存在异常甲基化。

RNA干扰(RNAi)是一种在mRNA水平上高度特异性沉默基因的机制，由于合成的小干扰RNA(siRNA)体积小、包封率高及安全性高，已成为重要的核酸类药物，用于多种疾病的治疗[15]。已有多项研究表明，抑制基因表达可降低KFB生长，如转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达，从而抑制了瘢痕疙瘩生长[16]；siRNA沉默DNMT1基因可抑制KFB生长，并诱导凋亡[17]。本研究结果显示，沉默DNMT1可抑制KFB活力和侵袭能力。

Wnt/β-catenin信号在细胞增殖、分化、侵袭迁移、凋亡及肿瘤形成等多种生理活动中发挥重要作用。近年来越来越多的研究也表明，Wnt/β-catenin信号通路与多种纤维化疾病的发病机制存在密切关系[18-19]。如Wnt/β-catenin信号通路的关键分子β-catenin在瘢痕疙瘩组织中表达明显升高，TGF-β刺激可上调成纤维细胞Wnt/β-catenin信号[20]。以上结果提示，在包括瘢痕疙瘩在内的纤维化疾病中Wnt/β-catenin信号发挥重要作用，且可能是潜在的治疗靶点。而也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信号可以降低KFB增殖，如Wnt信号通路抑制剂IWR-1可抑制成纤维细胞增殖、迁移及胶原生成等[21]。PCNA与细胞周期进展、细胞增殖密切相关。已有研究结果表明，PCNA表达水平可有效反映瘢痕组织增生程度[22]。MMP-2是MMPs家族成员，其主要负责基底膜上的Ⅳ型胶原降解。有研究表明，瘢痕疙瘩的侵袭迁移机制与MMP-2存在密切关系，抑制MMP-2的表达可降低KFB侵袭能力[23-24]。本研究结果显示，沉默DNMT1表达可下调β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2表达，提示沉默DNMT1表达可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而降低KFB增殖和侵袭能力。

综上所述，本研究显示沉默DNMT1表达可抑制KFB增殖和侵袭能力，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。提示DNMT1有可能是瘢痕疙瘩治疗的一个新靶点。但DNMT1上游调控基因有哪些，是如何调控DNMT1基因表达而参与瘢痕疙瘩发生及发展过程均尚需进一步探究，这可为进一步揭示瘢痕疙瘩发生及发展的分子机制奠定实验基础。