犊牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

曹贵忠

（青海省西宁市湟源县畜牧兽医站 812100）

犊牛腹泻在奶牛及肉牛养殖业中十分常见，其中大部分的发病原因为感染了致病性大肠杆菌。大肠杆菌在人类及动物肠道内非常常见，由于环境不同，肠杆菌毒素也不同，使得一些特殊的大肠杆菌产生致病性，犊牛尤其是一周龄以内的犊牛由于抵抗力较低，在遇到致病性大肠杆菌时发病率十分高。具有致病性的大肠杆菌通过发病牛排泄物还可能传染给周围环境的家畜及人类，导致被感染者出现一系列症状，最严重的可能会引起死亡，因此，防控该类疾病十分重要。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料采自青海湟源县某肉牛场病死犊牛肝、脾、肠道内容物样品，无菌低温保存。

1.2 剖检与样品采集

对病死犊牛进行现场剖验，发现其共同症状为胃肠道出血、肝脾及淋巴结肿大等典型症状[1]，分别采集肝脏、脾脏、肠道发病部位病料一份，无菌保存，标记备用。

1.3 试验材料及仪器

接菌环、手术剪刀，无菌生理盐水，无菌试管、麦康凯培养基、高压灭菌锅、生化试验试剂、血平板、麦康凯培养基、伊红亚甲蓝培养基等。

1.4 细菌的分离与培养

无菌条件下将无菌采集到的肝脏、脾脏、肠道内容物分别均匀地涂于血平板上，将接种好的血平板做好标记，并放置于恒温培养箱中，温度设定为37℃，经过24h 的培养后观察是否有细菌生长以及菌落的形态、颜色、大小等情况。镜检后根据情况可进行鉴别培养。

1.4.1 涂片染色镜检

分离出细菌的培养基要进行染色鉴定。挑取单菌落处理后进行革兰氏染色，在显微镜下观察其形态，可以对观察到的菌体形态进行初步鉴定。

1.4.2 分离培养与鉴定

革兰氏染色后观察细菌形态，初步判断细菌种类。

1.5 大鼠致病性试验

在无菌环境下，挑取单菌落接种于含有10%犊牛血清的营养肉汤培养液中，37℃，培养16h 后，将4 只小鼠分为2 组，每组两只，实验组小白鼠腹腔注射含量108cfu/ml 的菌液0.2ml，另一组腹腔注射0.2ml 的培养液。观察小鼠后续反应。

1.6 生化性质鉴定试验

将腹泻死亡的犊牛中致病菌和小鼠体内分离到的细菌在无菌环境下进行生化性质鉴定。

1.7 药物敏感性试验

采用K-B 法进行药物敏感性试验，CLSI 标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养结果

由表1 可知，通过单菌落的形态颜色及鉴别培养接的培养结果显示，分离到的菌落在普通营养培养基上的形态为乳白色、菌落边缘光滑、凸起的毒株；血平板中培养可见溶血，中等菌落的细菌；麦康凯培养基中可见红色，中等菌落；伊红亚甲蓝培养基中黑色、中等菌落。通过以上的培养鉴别可以初步确定为大肠杆菌。

表1 细菌分离培养结果

2.2 涂片染色镜检结果

革兰氏染色后在显微镜下可以观察到红色的杆状细菌，大小中等，无芽孢。有的细菌近似球状，有的细菌近似丝状，不呈链式分裂。

2.3 动物致病性实验结果

将实验动物分别腹腔注射菌液和培养基后，在饲料、饮水、垫料等环境相同的情况下发现，试验组小鼠在注射细菌后的第二天出现腹泻症状，第三天全部死亡；对照组小鼠健康存活，未出现腹泻。剖检病死鼠后对肠道内容物进行细菌分离鉴定，分离得到的细菌在培养基培养与镜检结果与之前在腹泻致死犊牛肠道内容物中的细菌形态及性质相同。本试验结果可证明该菌株有较强的致病性。

2.4 细菌的生化试验结果

将犊牛肠道内容物分离到的细菌和小鼠肠道内容物分离到的细菌接种于表2 的生化管中，通过培养结果可以看到，该菌符合大肠杆菌的生化特性。

表2 试验结果

2.5 细菌药敏试验结果

在药物敏感性试验中选取林可霉素、青霉素等6 种抗菌药进行抑菌试验，该细菌对青霉素、卡那霉素敏感，对大观霉素、阿莫西林、头孢拉定、多西环素耐药。

3 讨论

大肠杆菌广泛存在于人类及家畜肠道中。在饲养过程中为了更好地避免出现大肠杆菌感染，从业人员要在平时工作中加强饲养管理。保障养殖场内饲料安全无污染，及时清理动物粪便，在适宜的时间做好疾病防控工作。在肉牛养殖场中，尤其要做好犊牛保健工作。当出现由于致病性大肠杆菌引起的犊牛腹泻后，要进行合理治疗，尽量减少经济损失。

通过本次犊牛腹泻的发病情况可以看到，药敏试验中使用的6 种药物有4 种产生了耐药性。这也提醒相关工作人员要做好有针对性的用药，避免出现滥用药情况。近年来，乱用药的现象比较常见，使得耐药性越来越严重。希望越来越多的肉牛养殖场可以通过采用无抗养殖的方法饲养肉牛，减少抗生素的使用，提高饲养管理水平，提高家畜免疫力，杜绝滥用药物。