红土沉香中5,6,7,8-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮类化合物的研究

2022-01-13梅文莉袁靖喆魏艳梅宋希强戴好富

中草药 2022年1期

何棣，王昊，梅文莉，袁靖喆，杨理，魏艳梅，宋希强，戴好富*

何棣1, 2，王昊2，梅文莉2，袁靖喆2，杨理2，魏艳梅2，宋希强1，戴好富2*

1. 海南大学林学院，海南海口 570228 2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室海南热带农业资源研究院，海南海口 571101

研究红土沉香中的化学成分。采用硅胶、凝胶、高效液相色谱等多种色谱技术分离纯化得到单体化合物，通过质谱、核磁共振等现代波谱学方法鉴定其结构。从红土沉香乙醇提取物得到11个化合物，分别是(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（1）、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（2）、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基] 色酮（3）、沉香四醇（4）、异沉香四醇（5）、5α,6β,7α,8β-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮（6）、5α,6β,7α,8β-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（7）、aquilarone D（8）、aquilarone C（9）、aquilarone A（10）、aquilarone B（11）。化合物1为新化合物，以上5,6,7,8-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮类化合物（1～11）均首次从红土沉香分离得到。抗炎活性测试结果表明化合物均无抑制脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮的活性。

红土沉香；柯拉斯那沉香；5,6,7,8-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮；抗炎活性；(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮；沉香四醇

沉香为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属Lam. 或拟沉香属Gaertn.植物含有树脂的木材，是天然香料和名贵的传统药材，在医药、香文化、日化等方面广泛使用。健康的沉香树不会产生沉香，只有受到外界伤害，才会在伤口处分泌出树脂形成沉香。目前，已从沉香中分离鉴定400余个化合物，主要为倍半萜和2-(2-苯乙基) 色酮两类化合物[1]。现代药理研究表明，沉香中的化学成分具有镇静镇痛、降血糖、抗肿瘤、抗菌和抗炎等作用[2-3]。本研究组前期对白木香(Lour.) Spreng.、丝沉香(Oken) Merr.、柳叶拟沉香Ridl. 以及柯拉斯那沉香Pierre ex Lecomte的化学成分进行了系统的研究，发现了一系列结构新颖、活性显著的倍半萜和2-(2-苯乙基) 色酮类化合物[4-6]。

红土沉香主要产自越南，为柯拉斯那沉香倒地后被埋于红土中缓慢形成，表面红褐色或土黄色，色泽暗淡，木心紫褐色，油脂分布明显，质地硬，较难切割。红土沉香结香方式特殊，不同于普通柯拉斯那沉香，其珍贵稀有，素有“千年沉香，万年红土”之说，价格可与高品质沉香奇楠相媲美[7]。目前，尚未见关于红土沉香的物质基础研究。本课题组对红土沉香的乙醇提取物进行了系统的研究，首次分离鉴定了11个5,6,7,8-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮类化合物（图1），分别为(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮[(5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone，1]、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮 [(5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl) ethyl]- 5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone，2]、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基] 色酮 [(5,6,7,8)-2-[2-(3-hydroxy- 4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8- tetrahydrochromone，3]、沉香四醇（agarotetrol，4）、异沉香四醇（isoagarotetrol，5）、5α,6β,7α,8β-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮（5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2- [2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone，6）、5α,6β,7α,8β-四羟基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl) ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone，7）、aquilarone D（8）、aquilarone C（9）、aquilarone A（10）、aquilarone B（11）。其中，化合物1为新化合物。本研究为红土沉香的标准制定和开发利用奠定了基础。

图1 化合物1～11的结构

1 仪器与材料

安捷伦1260分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；安捷伦1260半制备型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Bruker AV-500型超导核磁仪（德国Bruker公司）；质谱仪（Bruker amazon SL公司）；紫外光谱仪（UV-2550 Shimadzu）；红外光谱仪（Nicolet 380美国Thermo公司）；旋光仪MCP 5100（奥地利Anton Paar有限公司）；CA-1111冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；BSA-100A自动部分收集器（上海青浦沪西仪器厂）；旋转蒸发仪（德国Heidolph Laborota公司）；METTLER TOLEDO ME204精密和分析天平［万分之一，梅特勒-托力多仪器（上海）公司］；超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；ELX-800酶标仪（美国宝特公司）；色谱硅胶板G，柱色谱硅胶G、H（200～300、60～80目，青岛海洋化工厂）；ODS（20～45 µm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司）；Sephadex LH-20（德国Merck公司）。小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购买于中国科学院干细胞库；DMEM培养基、胎牛血清（赛默飞世尔科技公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Griess试剂、槲皮素、四甲基偶氮唑蓝（美国Sigma公司）。

红土沉香样品于2017年购于广西凭祥，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所戴好富研究员鉴定其基原植物为柯拉斯那Pierre ex Lecomte，标本（YNHT201711）样本保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

2 提取与分离

红土沉香样品（1.6 kg）粉碎后超声提取6次（每次加入95%乙醇5.0 L，超声45 min），减压浓缩得到浸膏（330.6 g）。随后将浸膏分散至水中，依次用石油醚（5 L×3）、醋酸乙酯（5 L×3）和正丁醇（5 L×3）萃取。浓缩后将醋酸乙酯相浸膏（131.0 g）经减压硅胶柱色谱进行分离，以氯仿-甲醇系统（1∶0～0∶1）梯度洗脱，浓缩后经TLC薄层色谱检测，合并得26个流分（Fr. 1～26）。Fr. 25（12.0 g）经ODS柱色谱，以甲醇-水（3∶10～1∶0）为流动相进行梯度洗脱，经HPLC分析后，合并得到8个流份（Fr. 25-1～25-8）。Fr. 25-4（471.8 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）洗脱，得到Fr. 25-4-1～25-4-2。Fr. 25-4-2（124.9 mg）经半制备高效液相色谱（C18柱，乙腈-水（15∶85），等度洗脱；体积流量4 mL/min；检测波长254、210 nm）分离纯化得到化合物1（2.0 mg，R＝26.5 min）、2（13.0 mg，R＝23.5 min）、3（1.0 mg，R＝8.5 min）、4（5.0 mg，R＝21.5 min）、5（1.0 mg，R＝28.5 min）、6（1.4 mg，R＝17.0 min）、7（1.9 mg，R＝32.0 min）、8（2.2 mg，R＝10.5 min）、9（4.3 mg，R＝36.0 min）、10（3.0 mg，R＝11.5 min）、11（2.1 mg，R＝34.0 min）。

3 结构鉴定

表1 化合物1的1H-NMR 和13C-NMR 数据(500/125 MHz, CD3OD)

Table 1 1H- and 13C-NMR spectral data of compound 1 (500/125 MHz, CD3OD)

碳位δCδH 2171.4, C 3114.2, CH6.10 (s) 4180.7, C 564.2, CH4.83 (d, J = 3.9 Hz) 671.8, CH3.46 (dd, J = 10.5, 3.9 Hz) 773.2, CH3.95 (dd, J = 10.5, 7.7 Hz) 873.0, CH4.35 (d, J = 7.7 Hz) 9165.1, C 10121.7, C 1′133.1, C 2′130.4, CH7.12 (d, J = 8.6 Hz) 3′115.0, CH6.81 (d, J = 8.6 Hz) 4′160.0, C 5′115.0, CH6.81 (d, J = 8.6 Hz) 6′130.4, CH7.12 (d, J = 8.6 Hz) 7′36.5, CH22.89 (m) 8′32.8, CH22.95 (m) 4′-OCH355.6, CH33.74 (s)

图2 化合物1的关键2D NMR相关信号

图3 化合物1的计算ECD图谱与实测ECD图谱对比

4 抗炎活性测试

采用LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7模型测试化合物的抗炎活性[18-21]。RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。细胞按1×105个/mL接种于96孔板中，分别设对照组（不加LPS）、LPS诱导组、阳性药槲皮素（3 mmol/L）组和受试药物高、中、低剂量（50、25、12.5 mg/L）组，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中贴壁24 h后，取100 μL于新的96孔板中，之后向每孔加入100 µL（40 mg/mL）Griess试剂，混匀后于酶标仪540 nm波长下测定各孔的吸光度（）。按公式计算NO抑制率。最后利用GraphPad Prism软件处理数据，求得化合物对LPS诱导RAW 264.7产生NO的半抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）。

抑制率＝(2－1)/(2－0)

0、1、2分别为540 nm下测得的对照组、药物组、LPS诱导组的值

实验结果显示，化合物1～11均无抑制LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生NO的活性。

5 讨论

目前已从普通柯拉斯那沉香中发现了9个倍半萜类化合物[22-24]，30个2-(2-苯乙基) 色酮类化合物[24-31]，3个2-(2-苯乙烯基) 色酮[28]，18个2-(2-苯乙基) 色酮二聚体[27,32-35]，9个2-(2-苯乙基) 色酮与倍半萜二聚体[35-36]，仅分离得到4个5,6,7,8-四羟基- 2-(2-苯乙基) 色酮[26,30]以及5个环氧5,6,7,8-四氢- 2-(2-苯乙基) 色酮[27,30,37]。本实验从红土沉香中分离鉴定出11个5,6,7,8-四羟基-2-(2-苯乙基) 色酮类化合物，并且均是首次从柯拉斯那沉香中分离得到，其中化合物1为新化合物。红土沉香中的化合物类型不同于普通柯拉斯那沉香，原因可能是结香方式不同影响了所产沉香的化学成分，需要进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on 5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone derivatives of red soil agarwoodfrom Vietnam

HE Di1, 2, WANG Hao2, MEI Wen-li2, YUAN Jing-zhe2, YANG Li2, WEI Yan-mei2, SONG Xi-qiang1, DAI Hao-fu2

1. College of Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China 2. Hainan Key Laboratory of Research and Development of Natural Product from Li Folk Medicine, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China

To investigate the chemical constituents from red soil agarwood () from Vietnam.All compounds were purified by using various chromatographic techniques, including silica gel, Sephadex LH-20, high performance liquid chromatography (HPLC) and so on. Their structures were elucidated based on modern spectroscopic methods, such as mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).Eleven tetrahydro-2-(2-phenylethyl) chromones were isolated from ethanol extract of red soil agarwood from Vietnam and identified as (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]- 5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone (1), (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8- tetrahydrochromone (2), (5,6,7,8)-2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone (3), agarotetrol (4), isoagarotetrol (5), 5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone (6), 5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone (7), aquilarone D (8), aquilarone C (9), aquilarone A (10), and aquilarone B (11).Compound 1 is a new compound. All compounds were isolated from red soil agarwood for the first time. The results of anti-inflammatory activity assay showed that these compounds did not inhibit the NO production in mouse mononuclear macrophages RAW264.7 induced by LPS.

red soil agarwood;Pierre ex Lecomte;5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone; anti-inflammatory activity; (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone; agarotetrol

R284.1

0253 - 2670(2022)01 - 0018 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.004

2021-04-29

海南省重点研发计划项目（ZDYF2020160）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项（1630052021014，1630052017003）

何棣（1996—），男，在读硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail: hedinpc@126.com

戴好富（1974—），男，博士，研究员，主要从事天然产物化学研究。E-mail: daihaofu@itbb.org.cn

[责任编辑王文倩]