HPLC法检测蔓荆子中蔓荆子黄素的含量

陈贞明

（福建片仔癀化妆品有限公司，福建漳州，363000）

蔓荆子（Vitex trifoliaL.）是我国传统中药，为马鞭草科植物单叶蔓荆的果实，在最早的药学专著《神农本草经》就有所记载。主要产于我国山东、江西、浙江等地。秋季果实成熟，晒干、去净杂质作为临床中药使用，味辛，苦，性微寒，能疏散风热，清利头目。单叶蔓荆的化学成分主要是黄酮类、二萜类、木脂素类、环烯醚萜类等，其中黄酮类含量最高［1］。单叶蔓荆中的黄酮类成分具有抑菌活性、抗炎活性，可镇痛、舒张血管等；二萜类成分具有抗氧化活性、细胞毒活性等，还有一些其他化学成分的功效也逐步得到研究。因此，单叶蔓荆具有较广泛的药理作用，具有解热镇痛、抗炎、抗肿瘤、降血糖［2-5］等作用。

蔓荆子黄素属于多甲氧基黄酮类化合物，是单叶蔓荆的主要黄酮类成分，具有抗肿瘤、抗炎、舒张血管、抑菌等作用［6-9］。蔓荆子黄素在干燥成熟果实中含量最高，比干燥叶片含量高约40%［10］；不同的炮制方法对药材中蔓荆子黄素的含量也有所影响，其中酒浸烘制可使其含量最高［11］。相关文献指出，生品蔓荆子经过炮制后黄酮类成分含量有所下降，水溶性浸出物增加，除了参考蔓荆子黄素含量，还应结合高效液相色谱法或其他方法反映蔓荆子炮制质量，进一步揭示蔓荆子的炒制科学内涵［12］。

1 仪器与材料

1.1 试验仪器

Waters e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；UTP-313 型电子天平（上海花潮电器有限公司）；KQ—210A 型超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）；FSJ-A03D1 小型粉碎机（小熊电器股份有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪器（苏州赛恩斯仪器有限公司）；SHB-IIIA 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）

1.2 试验材料

蔓荆子（亳州市弘宝堂商贸有限公司）；蔓荆子黄素对照品（分析标准品≥99.5%，阿拉丁）；甲醇（北京生化科技有限公司）；乙腈（北京生化科技有限公司）；乙醇（南京化学试剂有限公司）

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

采用乙醇回流法提取蔓荆子中蔓荆子黄素。准确称取100 g 蔓荆子药材，放入小型粉碎机粉碎。料液比1∶15，分两次提取，向圆底烧瓶中加入30%乙醇，置于电热套连接冷凝器进行热回流提取，每次提取时间为3 h。提取后溶液放置室温后过滤，3500 r/min离心15 min后抽滤，得到上清液即为蔓荆子提取液。将蔓荆子提取液放入旋转蒸发仪器减压回收溶剂直至浸膏，放入真空干燥箱烘干后得到蔓荆子提取物。提取物中加入适量甲醇配置成0.1 mg/mL蔓荆子溶液，过0.22µm有机膜过滤备用。

2.2 对照品溶液的制备

取蔓荆子黄素对照品适量，加甲醇定容至25 mL 棕色量瓶中，摇匀，制得质量浓度为0.1 mg/mL的蔓荆子黄素储备液。

2.3 色谱条件

色谱柱选择 Aglient C18 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇-体积分数0.05%磷酸（体积比70∶30）。检测波长为322 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为20µL，柱温为30 ℃。见图1。

图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance

2.4 线性关系考察

将蔓荆子黄素母液稀释成 12.5、25、50、100、200 µg/mL，精密吸取20 µL，按照2.3 项下的色谱条件进样分析。以蔓荆子黄素进样的浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，并计算出蔓荆子黄素的线性回归方程为Y = 1.42× 104X - 2.172×102，R2=0.9997。结果表明，蔓荆子黄素的浓度范围在12.5～200µg/mL，其峰面积与进样的浓度具有良好的线性关系。见图2。

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of test article

2.5 精密度考察

取供试品溶液，按色谱条件进样20µL，重复进样6次，记录色谱图，记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素的RSD 为0.71%（n = 6），小于3.0%，表明该方法的精密度良好。

2.6 稳定性考察

按2.2 项下方法新配制蔓荆子供试品溶液，室温下放置，分别在 0、2、4、6、8、10、12 h 进样，记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素RSD为1.05%（n = 7），小于3.0%，结果表明本蔓荆子供试品溶液在12 h内保持稳定，表明该方法稳定性良好。

2.7 重复性考察

取蔓荆子粉末6 份，分别按2.2项下实验方法配制溶液，按色谱条件进行分析，记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素的RSD 为0.96%（n=6），小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率测定

分别精密吸取2.2 项下蔓荆子黄素对照溶液2、2、3、3、4、4 mL，置于20 mL 容量瓶中，挥干，取 6 份已知含量的供试品溶液加入容量瓶中，加入甲醇溶液稀释至刻度，取20 µL 分别注入高效液相色谱仪器中。按照色谱条件，测定蔓荆子黄素含量，并计算加样回收率，结果见表一。

表1 蔓荆子黄素加样回收率试验结果Table 1 Test results of sample recovery of vitexin

2.9 样品含量测定

取3 批蔓荆子药材，精密称定，按照2.2 项下制成供试品溶液，按照色谱条件进行测定。根据标准曲线计算蔓荆子中蔓荆子黄素的含量，结果见表2。

表2 不同编号蔓荆子样品中蔓荆子黄素含量Table 2 Content of vitexin in Vitex trifolia samples with different numbers

3 讨论

蔓荆子化学成分复杂，其黄酮类、萜类等主要成分在多个方面具有治疗功效。通过对蔓荆子的化学成分进行分析，发现蔓荆子黄素对齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等疾病具有明显的治疗作用，表明其临床应用具有很大的潜能性。

本试验通过对高效液相色谱条件的优化，得出了较好的蔓荆子黄素的出峰时间，并判断出了在254 nm 处有最好的吸收效果，因此选择254 nm作为高效液相色谱的检测波长。试验通过对蔓荆子黄素标准品溶液进样，进行梯度洗脱以确定试验中流动相的大体比例，后采用等度洗脱对流动相的比例进行调整，进一步选择最适合于该试验的流动相比例，来达到优化的目的，使试验的结果更加准确。