抗核抗体及抗中性粒细胞胞浆抗体与胆道闭锁严重程度和预后的相关性研究

李轲鑫 刘立伟 李敏 王昱 马子坤 郭甜甜 孙丽莹 朱志军 贾继东 赵新颜

胆道闭锁(Biliary atresia，BA)是一种致命性的新生儿纤维炎性胆管破坏性疾病[1, 2]，它是新生儿胆汁淤积性肝病的最主要原因，是儿童肝硬化及肝源性死亡的首要原因[3]，同时也是儿童肝移植的最主要适应证[4- 5]。其病因尚未明确，发病率为1/3 000～20 000，且在亚洲地区更为常见[3, 6-7]。及时行葛西手术(Kasai procedure，KP)可显著改善BA预后延长患儿生存期[8- 9]，但仍有50%～80%的患儿最终需要行肝移植手术以挽救生命[1, 9, 10]。

近年来的研究表明，体液免疫尤其是自身免疫失调在BA中发挥了重要作用[11-17]，但关于BA患儿血浆中自身抗体的报道较少或结果不一致。抗核抗体(Antinuclear antibodies，ANA)及抗中性粒细胞胞浆抗体(Antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)作为临床实践中常见的自身抗体谱可见于多种自身免疫性肝病，但国内尚未系统研究ANA和ANCA在BA中的表达情况及其临床意义。本研究检测BA患儿血浆中ANA和ANCA 的表达情况，并分析二者与肝移植术前实验室检查、严重程度、肝脏病理组织学表现及术后并发症的相关性，旨在为自身抗体在BA中的预后价值提供实验依据。

资料与方法

一、研究人群

选取2017年4月至2020年10月于首都医科大学附属北京友谊医院行肝移植手术的BA患儿。纳入标准：(1)术中胆道造影确诊BA；术后病肝病理学检查符合BA；(2)外周血和肝组织样本保存于样本库中可以获取。排除标准：(1)病理诊断不符合BA的其他胆汁淤积性肝病(如进行性家族胆汁淤积性肝病、Alagille综合征等)；(2)患儿或其母亲患自身免疫性疾病者(如自身免疫性肝炎、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、血管炎等)；(3)二次肝移植者。本研究方案已通过首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会批准(批件号：2020-P2-226-01)。

二、研究方法

(一)收集患儿术前基础资料 收集入组患儿的人口学及临床资料，肝移植术前血常规、肝功能生化及凝血功能指标，计算Child-Pugh评分及儿童终末期肝病模型评分(Pediatric End-stage Liver Disease score，PELD)[18]。

(二)ANCA和ANA检测 通过酶联免疫吸附法检测术前血浆中的抗核抗体谱IgG(欧蒙，中国，EA 1590-9601-8G)，包含以下抗原：dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、nRNP、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1和着丝点。血浆样本进行1∶201稀释，ANA比值=样本吸光度值/校准品吸光度值，比值≥1.0为阳性，<1.0为阴性。

通过间接免疫荧光法定性检测抗中性粒细胞胞浆抗体IgG(欧蒙，中国，FA 1201-1010-13)。血浆样本进行1∶10稀释，ANCA阳性定义为抗体滴度≥1∶10，并根据荧光特征分为胞浆型(cANCA)和核周型(pANCA)。

(三)病理组织染色及评分 将肝移植术中切除部分病肝组织固定、包埋，制备石蜡切片，行HE、Masson、网织、铜、铁染色。根据标准化评分系统对BA患儿的汇管区炎症、肝纤维化、细胆管胆栓及肝细胞淤胆进行病理组织学评分[19-20]。

(四)肝移植术后随访 通过医院管理系统(HIS系统)进行肝移植的术后随访：(1)术后第1周、第2周及第4周的ALT和总胆红素(Total bilirubin，TBil)的动态变化；(2)术后巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)感染，胆道和血管并发症，排斥反应，肝相关死亡等事件的发生情况。随访时间定义为肝移植手术至随访1年或死亡的时间。

三、统计学分析

所有数据均采用IBM SPSS Statistics Version 24.0软件进行分析。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，非正态分布则用中位数及四分位数表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-Wallis检验；计数资料以频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析中，双变量正态分布计算Pearson积矩相关系数，否则计算Spearman秩相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、BA患儿的人口学特征及临床资料

根据入排标准，本研究共纳入2017年4月至2020年10月于首都医科大学附属北京友谊医院行肝移植手术的BA患儿98例，包括未行葛西手术者30例，葛西术后行肝移植术者68例。入组患儿中，男性52例(53.0%)，女性46例(46.9%)，中位月龄为9.0月。ALT中位水平198.5(91.3, 434.5)U/L, AST中位水平332.4(139.7, 582.4)U/L，TBil中位水平137.9(38.9, 341.4)μmol/L，总胆汁酸(TBA)中位水平134.2(73.2, 244.2)μmol/L。肝移植术前Child-Pugh评分和PELD评分中位值分别为6.3(8.0, 10.0)和13.0(1.0, 23.8)。肝硬化(S4期)患儿所占比例较高，达71.4%(70/98)。见表1。

表1 三组BA患儿的人口学特征及临床资料比较

续表1

二、肝移植术后随访结果

与术前相比，肝移植术后第1周、第2周、第4周ALT和TBil水平显著下降(ALT：198.5 vs 150.5 vs 38.0 vs 28.5 U/L，P<0.001；TBil：137.9 vs 33.2 vs 17.7 vs 10.3 μmol/L,P<0.001)。术后非嗜肝性病毒感染率较高，其中CMV感染率为36.7%(36/98)，EBV感染率为61.2%(60/98)。出现胆道、血管并发症，排斥反应，肝相关死亡事件分别为4例(4.1%)、6例(6.1%)、6例(6.1%)、2例(2.0%)。

三、ANA半定量比值与术前严重程度、病理组织学评分及术后CMV感染的相关性

90例患儿检测了血浆抗核抗体，3例(3.3%)ANA阳性，未行葛西手术者2例，葛西术后者1例。ANA半定量比值与术前严重程度的相关性分析显示，ANA半定量比值与Child-Pugh评分和PELD评分均呈正相关，相关系数分别为0.257(P=0.016，图1A)和0.230(P=0.031，图1B)，但相关程度较弱。而且在葛西术后的BA患儿中，ANA半定量比值随葛西术后自体肝生存时间的延长而降低(P=0.011，R=-0.326，图1C)。病理组织学评价中，ANA比值在BA肝硬化(S4期)患儿中显著升高(P=0.016，表2)；存在胆汁淤积的患儿ANA比值更高，且随着细胆管胆栓程度的加重而升高(P=0.040，表2)，肝细胞淤胆≥2分的患儿ANA半定量比值有升高趋势，但差异无统计学意义；汇管区炎症程度与ANA半定量比值无显著差异。肝移植术后发生CMV感染的患儿ANA半定量比值较未发生者显著升高(P=0.034，表2)。EBV感染者ANA比值有升高趋势，但差异无统计学意义。ANA半定量比值与术后排异反应、ALT和TBil的动态变化及生存情况未见显著相关性。

注：肝功能储备分级(Child-Pugh评分，图A)、儿童终末期肝病模型(PELD)评分(图B)均与ANA比值呈正相关；在葛西术后的BA患儿中，ANA半定量比值随葛西术后自体肝生存时间的延长而降低(图C)。ANA：抗核抗体；KP：葛西手术；葛西术后自体肝生存时间：葛西手术距肝移植的时间(月)。

表2 ANA半定量比值与不同病理组织学评分及术后有无CMV感染的比较

四、ANCA阳性患儿Alb、CHE水平显著降低

BA患儿中有10.2%(10/98)为ANCA阳性，其中1例为cANCA 1∶10阳性，9例为pANCA阳性，1∶10、1∶32、1∶100阳性各3例。

比较ANCA阳性与阴性患儿的术前实验室检查发现，ANCA阳性患儿术前的白蛋白(Alb)、胆碱酯酶(CHE)水平显著低于ANCA阴性者(Alb: 30.4 vs 34.3 g/L,P=0.018; CHE: 2.6 vs 3.9 KU/L,P=0.009，表1)，提示ANCA阳性患儿的肝脏合成功能受损更为严重；术后第1、2、4周TBil逐渐下降，且同一时间段内ANCA阳性者的TBil更低(34.2 vs 25.9，18.2 vs 15.2，11.0 vs 6.7 μmol/L，表1)，复常率更高。ANCA阳性患儿术前病理组织学评分、严重程度评分及术后非嗜肝性病毒感染、血管并发症、胆管并发症等均与ANCA阴性患儿间差异无统计学意义。

讨 论

本研究中BA患者肝移植术前ANA阳性率为3.3%，低于既往研究报道的葛西术前ANA阳性率11.3%[17]。其半定量比值与反映疾病严重程度的Child-Pugh评分和PELD评分呈正相关(尽管相关程度弱)。在我们的前期研究中发现，葛西手术可改善BA患儿的肝脏病理[21]，而本研究中葛西术后患儿的ANA比值低于未行葛西患儿(0.22 vs 0.26，P=0.087)，且ANA比值在有肝硬化的患儿中显著升高，并随着胆汁淤积程度的加重而升高，提示ANA比值与BA的病理特征具有一定相关性。

肝移植术前ANCA阳性率(10.2%)同样低于先前报道的葛西术前ANCA阳性率(29.0%)[17]。肝功能生化指标中，已报道有3种IgM自身抗体水平与TBil和AST正相关[12]，而我们发现，ANCA阳性患儿肝移植术前的Alb、CHE水平更低，肝脏的合成功能更差；但术后第1、2、4周ANCA阳性者的TBil水平更低，复常率更高，其机制尚待进一步研究。

在术后并发症方面，有学者发现ANCA阳性与葛西术后胆管炎发生率呈正相关[17]，与CMV感染无关。而本研究中，肝移植后发生CMV感染的患儿ANA比值显著升高，但与术后胆道、血管并发症，排异反应，肝相关死亡事件无显著相关性。

既往研究表明，体液免疫在BA的发病过程中有至关重要的作用，且BA患儿中存在不同程度自身抗体阳性。轮状病毒感染的BA小鼠模型若缺乏用于抗体产生和抗原呈递的Ig-α(B细胞受体的组成部分)则不能引起BA，提示B细胞在介导BA的发病过程中起重要作用[14-15]。而且在BA患儿出生后的前几个月内，其肝脏中的B细胞淋巴细胞增殖持续存在，致病性IgG抗体明显增加，而B细胞修饰疗法可以改善BA小鼠的肝脏病理[11]。这提示B细胞是BA发病过程中必不可少的。以下发现更是提供了BA中存在自身抗体的直接证据：BA患儿中发现了沿肝外胆管上皮基底膜沉积的IgM或IgG[16]、血清中可检测到自身免疫性肝病相关的自身抗体[17]以及动物模型中发现的抗α-烯醇酶(胆管上皮抗原)自身抗体[13]。

本研究发现，BA患儿血浆中的ANA及ANCA与疾病的严重程度和预后具有相关性，并首次发现ANA半定量比值与BA病理特征中肝硬化(S4期)和胆汁淤积程度相关。目前BA的确诊依赖于术中胆管造影和肝活检等侵入性诊断方法[11, 22]，自身抗体能否作为新的特异性标志物用于BA的无创诊断，尚有待展开进一步的研究。本研究为单中心回顾性研究，入组患儿处于疾病终末期，病情较重，不能完全代表疾病早期及BA的普遍情况。