Gao-Binge酒精性肝病模型小鼠的损伤特点

周梅月 全卉 陈贺宁 江宇泳

酒精性肝病(ALD)是全球肝病的主要类型,中国ALD的发病率也正在迅速增加[1-2]。越来越多的证据表明肠-肝轴机制是导致ALD的重要机制之一[3]。其以肠道通透性增加为形式的肠屏障功能障碍促进内毒素进入肝脏，触发了肝脏炎症的促炎级联反应[4-6]。此外，临床研究表明酒精依赖性受试者的肠道通透性增加主要局限于小肠，并且长期饮酒会导致血液中内毒素水平升高[7-8]。这些研究都证明了ALD的发生与肠屏障功能损伤、内毒素水平升高关系密切。本文通过微调Gao-Binge ALD小鼠模型，检测ALD模型小鼠血浆ALT、AST、内毒素水平，观察肝脏、小肠病理改变等，验证Gao-Binge ALD模型小鼠的损伤特点，为ALD模型的选择提供借鉴，并为“从肠治肝”的研究提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物

20只C57BL/6N雄性小鼠，SPF级，(20±2) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(京)2016-0006；合格证号：110011200107412545；饲养地：北京中医药大学东直门医院屏障环境动物实验室。

二、主要试剂

Lieber-DeCarli对照液体饮食、Lieber-DeCarli酒精液体饮食、麦芽糖糊精均购自Bio-Serv公司；无水乙醇购自北京化工厂；AST、ALT检测试剂盒购自富士胶片和光纯耀化学有限公司；内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司；Occludin抗体、Zo-1抗体购自ABCAM公司；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP-山羊抗兔IgG(H+L)购自Jackson公司; BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Cwbiotech公司；彩色预染蛋白分子量标准购自碧云天生物公司。

三、主要检测仪器

全自动生化分析仪(日本日立公司)，病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)，正置光学显微镜(日本尼康)，成像系统(日本尼康)，动态试管检测仪(湛江安度斯生物有限公司)。

四、动物分组与模型建立

适应性喂养一周后，将小鼠随机分为正常组和模型组，每组10只。ALD小鼠模型的制备：参考文献[9]并根据多次实验结果，调整制备ALD模型的喂食量以保证不同组别小鼠饮食热量相同(表1)：模型组小鼠首先使用Lieber-DeCarli对照液体饮食喂养5 d，然后使用含酒精的Lieber-DeCarli液体饮食喂养10 d，第16天清晨对模型组小鼠进行一次大剂量酒精(5 g/kg)灌胃。正常组小鼠造模期间给予对照液体饮食，并且保证与模型组小鼠等热量喂养。第16天清晨对正常组小鼠进行一次大剂量麦芽糖糊精(9 g/kg)灌胃。灌胃9 h后，眼球取血，颈椎脱位处死小鼠，并保留肝脏、小肠和外周血标本。

表1 造模方法

五、测定指标及方法

(一)肝脏指数与组织病理学检查 每日称量小鼠体质量，取材时，分离完整新鲜肝脏后称重，计算肝脏指数=肝脏湿重/体质量×100%。4%多聚甲醛固定肝组织和小肠组织后，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏和小肠病理变化。

(二)血浆生化指标检测 小鼠眼球取血后，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min后，分离得到血浆，使用全自动生化分析仪检测小鼠血浆中AST、ALT活性，使用动态试管检测仪通过光度测定法检测血浆内毒素水平。

(三)Western Blot 检测 小肠组织匀浆后，12 000 g离心15 min，取上清，进行蛋白定量。配胶，上样，电泳，转膜，封闭，分别在4 ℃冰箱孵育Zo-1、Occludin、β-actin一抗过夜。次日洗膜，二抗室温孵育1 h，洗膜，ECL显影，拍照。

六、统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料均以均值±标准差表示，两组计量资料均符合正态时，两组间比较采用独立样本t检验分析，若有一组计量资料不符合正态分布，则采用非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、小鼠一般情况及血生化指标比较

模型组小鼠与正常组小鼠造模前初始体质量和造模后最终体质量，两组比较均没有统计学差异(P均>0.05)，保证了造模过程中两组小鼠等热量喂养。模型组小鼠的肝脏指数较正常组小鼠肝脏指数显著增加(P<0.05)。与正常组相比，模型组小鼠血浆ALT、AST、内毒素水平均显著增高(P均<0.01)(表2)。

表2 小鼠一般情况、血生化指标比较

二、小鼠肝脏和小肠组织病理检查

肝脏组织HE染色结果显示：正常组小鼠肝细胞胞质较丰富，嗜酸性染色，细胞核圆并且清晰，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列整齐，无明显病变。模型组小鼠肝细胞排列紊乱，细胞界限模糊不清，大量肝细胞内出现大而融合脂滴，将核挤向一侧类似脂肪细胞，部分肝细胞核发生混浊肿胀，肝小叶结构不清，出现炎性细胞浸润。

小肠组织HE染色结果显示：正常组小鼠小肠的腺体排列整齐，上皮完整，黏膜正常，无明显病变。模型组小鼠小肠组织形态紊乱，部分腺体坏死脱落，甚至断裂，绒毛破损，上皮细胞和杯状细胞丢失减少，炎性细胞浸润，肠内血管扩张充血(图1)。

A：正常小鼠肝脏病理，×20；B：模型小鼠肝脏病理，×20；C：正常小鼠小肠病理，×20；D：模型小鼠小肠病理，×20

三、Western Blot 检测小肠组织紧密连接蛋白Zo-1和Occludin的表达情况

与正常组相比，模型组小鼠紧密连接蛋白Zo-1(P<0.05)和Occludin(P<0.01)的表达水平显著降低(图2)。

1、2分别为正常组、模型组

讨 论

动物实验研究可以提供一种更好的了解ALD发病机制的方法。但是，许多ALD动物模型之间差异较大，并非所有模型都能完全模拟人类ALD[10]。值得重视的是，在长期过量饮酒的人群中，约95%会出现肝脏脂肪变性，35%可逐渐发展为酒精性肝炎、肝纤维化甚至肝癌[11]。因此，建立和区分ALD不同阶段的动物模型对研究的准确性十分重要。

本研究通过多次实验得出结论，需调整小鼠喂食量以保证不同组别小鼠饮食热量相同。其中，模型组与正常组小鼠初始体质量和最终体质量均没有显著差异，说明造模过程中保证了两组小鼠之间等热量摄入，避免了因饮食摄入量不同造成的差异。同时本研究结果显示，模型组小鼠血生化指标AST、ALT显著升高，肝脏病理出现大量脂肪变和存在炎性细胞浸润。这表明Gao-Binge ALD模型与人类酒精性肝炎较为相似，为Gao-Binge ALD模型用于酒精性肝炎的研究使用提供了理论依据。另外，本实验结果显示小鼠血液中内毒素水平显著升高，小肠HE染色出现组织形态紊乱，绒毛破损，上皮细胞和杯状细胞丢失减少，炎性细胞浸润等病理改变，小肠组织中紧密连接蛋白Zo-1和Occludin的表达显著降低。这些数据证实了Gao-Binge ALD模型时小鼠肝脏发生损伤，同时肠道屏障功能被破坏，内毒素水平升高，验证了ALD的“肠-肝轴”理论[12-13]。尤其是小肠HE染色显示杯状细胞减少从病理角度验证了前人的研究成果：肠上皮中的杯状细胞产生保护性三叶因子和黏蛋白，对肠道屏障功能有保护作用[14]。另外很重要的是，构建Gao-Binge ALD模型时可通过添加辅剂模拟其他危险因素合并酒精性肝损伤，为探索ALD的危险因素或探究其他疾病与ALD之间的共同作用提供了很大便利[15]。

综上，肠道来源的内毒素等有害物质诱发肝脏炎症在ALD的发病和进展中发挥重要作用，但ALD治疗仍然是临床难点。选择合适的动物模型探讨ALD的发病机制和有效治疗方法意义重大。本研究观察了Gao-Binge ALD模型小鼠的肠道、肝脏组织损伤，血浆内毒素水平升高，为从“肠-肝轴”研究ALD动物模型的选择提供了理论支持，也为从肠治肝，提供了理论依据。然而Gao-Binge ALD模型亦存在一定的局限性，不能造成小鼠酒精性肝硬化的发生，对于酒精性肝硬化的研究，应另选其他经典模型。