基于分子对接研究甜菊醇、异甜菊醇对赤霉素受体GID1的作用机制

张 军，王 杭，于宁康，张 珂，韩文龙

(郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044)

赤霉素(gibberellins，GAs)是双萜类植物激素，是植物生长过程中必需的生长激素之一[1-2]，对植物从种子萌发到开花结果整个生长过程都担负着重要作用[3]。1938年，日本植物学家薮田首次发现赤霉素，至今已经分离确定了130多种，其中赤霉素GA3因其分布最广、活性最强，成为研究热点[4]。

随着“有机农业”的到来，人们对健康越来越关注。根据发酵工业网报道，全球赤霉素产量2016年达到480.9吨，年平均增长率为4.62%[5]。人工合成赤霉素在工农业生产中被大量使用，所产生的安全问题也越来越引起人们的重视。EL-MOFTY等[6]研究发现，赤霉素对小鼠肿瘤诱发率为18%(雄)和36%(雌)，饲喂14个月小鼠肺中发现支气管肉芽肿；许春爽[7]研究显示，赤霉素暴露可增加精子凋亡。因此，开发安全、对人类健康无任何毒副作用的赤霉素替代物成为重要的课题[8]。

甜菊醇、异甜菊醇来自甜菊糖(stevioside)的双萜贝壳杉烯母环。由于甜菊糖高甜、低热，安全性好，被称为世界第三种天然糖源[9]，FDA等批准其作为饮食补充剂使用。甜菊糖(Stevioside)经酶解或使用高碘酸钠和大量强碱处理可以得到甜菊醇(steviol)，甜菊醇在酸性条件下发生wagner-meerwein分子重排，生成异甜菊醇(isosteviol)，异甜菊醇也可以由甜菊糖经稀硫酸直接水解得到。甜菊醇与异甜菊醇互为同分异构体[10]，分子式为C20H30O3。OGORODNOVA等[11]发现甜菊醇、异甜菊醇可以刺激小麦生长，增强低温抗性；张亮等[12]研究发现，经异甜菊醇浸种处理的油菜种子发芽率、幼苗根长、叶绿素含量等明显提高；刘秀芳等[13]指出，甜菊醇、异甜菊醇促进水稻种子发芽活性优于赤霉素作用，但是没有对刺激生长信号机理进一步探讨。随着计算机技术的快速发展，研究配体-受体构效关系的建模技术已广泛应用于植物生理学、食品营养、制药等方面[14]。近二十年来对GAs作用机制的研究，揭示了GAs信号转导机制依赖于GID1蛋白的配体结合，进而发挥作用[15-17]。因此，本研究采用分子对接技术，以GAs受体蛋白GID1为靶点，以GA3为对照物，分析甜菊醇、异甜菊醇对赤霉素结合受体GID1蛋白[18-20]相互作用模式和机理，探讨对接结合自由能与活性相关性，为进一步开发赤霉素的安全替代物提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

AutoDock Vina分子对接软件[21]；AutoDock Tools 1.5.6蛋白对接软件，从美国斯克利普斯研究所官网(http://autodock.scripps.edu)下载；PyMol视图处理软件；LigPlot疏水性分析软件。

1.1.1 小分子配体准备

从zinc小分子数据库(https://zinc.docking.org/)中搜索赤霉素GA3(ZINC3860467)、甜菊醇(ZINC6491272)和异甜菊醇(ZINC4044743)分子3D结构(见图1)，保存为mol2格式文件。

图1 (a)赤霉素GA3，(b)甜菊醇和(c)异甜菊醇分子结构

1.1.2 受体蛋白准备

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载赤霉素受体GID1蛋白晶体结构，保存为PDB格式。GID1蛋白有351个氨基酸，来自于模式植物拟南芥。GID1受体蛋白三维结构见图2。

图2 GID1三维结构

1.2 方法

1.2.1 配体预处理

对赤霉素GA3、甜菊醇和异甜菊醇小分子进行质子化、计算电荷等处理，并检测出小分子可旋转键(见图3)。

图3 (a)赤霉素GA3，(b)甜菊醇和(c)异甜菊醇小分子可旋转键

1.2.2 受体预处理

用AutoDock Tools软件在PMV导入GID1受体蛋白，打开GID1分子，确认其加氢、电荷计算、质子化状态，进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。

1.3 对接

根据赤霉素与GID1结合位点，设置对接参数：

receptor = D:AutoDockprotein.pdbqt(受体蛋白文件位置)-> ligand = D:AutoDockligand.pdbqt(赤霉素分子文件位置)->out = all.pdbqt(输出格式为pdbqt)->center_x = 52.855 center_y = 58.616 center_z = 39.571(设置对接中心坐标)->size_x = 20 size_y = 20 size_z = 20(设置对接区域)->energy_range = 4(运算结果最大结合能之差)->exhaustiveness = 15(运算精度)->num_modes = 10(显示结果数)，保存为config.txt，之后运用程序语(“D:AutoDockGID1vina.exe” --receptor protein.pdbqt --ligand ligand.pdbqt --config config.txt --log log.txt --out out.pdbqt)进行对接。

2 结果与分析

2.1 对照物GA3与GID1配体蛋白的对接验证

利用分子对接软件AutoDock Vina构建对照物GA3与GID1酶的对接模型，确定并验证该条件的准确性。图4展示了对照物GA3与GID1酶的对接模式和氢键相互作用。

(A1)GA3与GID1蛋白结合区，(A2)GA3与GID1蛋白口袋 ，(A3)GA3与GID1蛋白相互作用图4 GA3与GID1的分子对接效果图

对照物GA3与GID1的分子对接用AutoDock分子对接软件，对接结合能最小为 -11.10 kcal/mol， 其均方根偏差refRMS值为1.36，一般refRMS值小于2就可认为小分子与蛋白质受体是有效对接[22]。由图4可见，对照物GA3与GID1酶能很好地结合，说明参数设置合适。把对接结果用可视化软件PyMol进行分析，结果显示配体作用位点具体为：ILE2-4，PHE-27，LYS-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，ILE-126，TYR-127，ASP-190，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323，其中与SER-116，TYR-127，SER-191和PHE-238作用位点形成氢键作用。由此可见，对照物GA3与GID1的主要作用力是范德华力和氢键作用。

2.2 甜菊醇、异甜菊醇与GID1配体蛋白的对接结果

为了进一步确定甜菊醇、异甜菊醇与GID1蛋白受体的结合情况，分析甜菊醇、异甜菊醇与GID1蛋白配体结合的本质，分别进行分子对接分析。经AutoDock Vina运算分析，采用半柔性对接方法，选择结合自由能最低的构象进行后续分析，得到甜菊醇、异甜菊醇与GID1蛋白受体的最佳复合结果。

图5为甜菊醇与GID1蛋白受体对接结果，表明其结合位点的位置。B1可看到结合位点区域，B2半透明区域表明甜菊醇进入GID1蛋白受体内部活性口袋，B3表示甜菊醇与GID1蛋白受体残基的相互作用。由图5甜菊醇与GID1蛋白受体对接结果，发现蛋白活性中心点氨基酸残基中，ILE-24，PHE-27，PHE-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，TYR-127，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323氨基酸残基最容易与甜菊醇配体相互作用，其中与蛋白受体PHE-238形成氢键。这些位于GID1蛋白受体的功能域内氨基酸均与甜菊醇相互作用形成氢键、范德华力等作用力，对接结合能最小为 -10.81 kcal/mol，对于GID1蛋白受体的抑制活性有着重要的作用。

(B1)Steviol与GID1蛋白结合区，(B2)Steviol与GID1蛋白口袋，(B3)Steviol与GID1蛋白相互作用图5 甜菊醇与GID1的分子对接效果图

由图6异甜菊醇与GID1蛋白受体对接效果图发现，异甜菊醇能与GID1蛋白受体结合，并可以进入GID1蛋白受体蛋白内部，与溶剂等形成活性包裹口袋，能与GID1蛋白受体氨基酸形成氢键。图6中C2表明异甜菊醇与GID1蛋白受体活性中心点ILE-24，PHE-27，LYS-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，TYR-127，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323氨基酸残基相互作用，其中与蛋白受体ARG-35，GLY-115，TYR-127和SER-191形成氢键，这些氨基酸残基均与异甜菊醇相互作用，形成氢键、范德华力等作用力，对接结合能最小为 -11.26 kcal/mol。在分子对接中，配体构象的结合自由能越低，构象越稳定，与蛋白质受体结合的亲和力就越强，对蛋白质受体可能具有的抑制活性越强[23]。说明异甜菊醇对GID1蛋白的活性抑制超过了GA3的活性，与刘秀芳等[13]研究结果一致。

(C1)Isosteviol与GID1蛋白结合区 ，(C2)Isosteviol与GID1蛋白口袋 ，(C3)Isosteviol与GID1蛋白相互作用图6 异甜菊醇与GID1的分子对接效果图

3 结论

植物化学“生源的异戊二烯法则”研究表明，赤霉素和甜菊糖都来自于同一代谢通路[24]，二者结构相似，都属于萜类。甜菊醇与异甜菊醇是也是甜叶菊糖在动物肠道中自然代谢产物[25]，其安全性已被人们广泛接受和了解，但其在植物赤霉素作用靶点GID1蛋白的作用机理方面目前尚不明确。本研究以GA3为对照物，以甜菊醇、异甜菊醇与GID1的相互作用为研究对象，分析其作为安全的植物生长调节剂的可能性。

AutoDock Vina分子对接结果表明，赤霉素、甜菊醇和异甜菊醇与赤霉素受体GID1蛋白的相互作用主要是形成氢键作用、范德华力等，主要作用基团为羟基，结合自由能分别为-11.10 kcal/mol，-10.81 kcal/mol和-11.26 kcal/mol，说明甜菊醇和异甜菊醇两种小分子都能与赤霉素受体GID1蛋白形成稳定结合，且异甜菊醇的作用效果强于赤霉素GA3。分子对接技术依赖于信息科学技术的发展，对接结果可能有偏差或者假阳性[26]，结果仅作为参考，是否真正有效还需通过后续实际验证。