基于肠道菌群代谢产物探索低FODMAPs饮食对腹泻型肠易激综合征的疗效及机制研究

俞蕾敏,翁敏娜,陈慧俊,叶 蔚,范一宏

俞蕾敏,翁敏娜,陈慧俊,叶蔚,浙江中医药大学附属杭州市中医院消化内科 浙江省杭州市 310007

范一宏,浙江中医药大学附属第一医院消化内科 浙江省杭州市 310006

0 引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是最常见的功能性胃肠道疾病之一,发病率较高,采用罗马Ⅳ标准[1],全球患病率为3.8%[2].随着近年来生活节奏加快、工作压力加大,我国人群IBS的患病率呈上升趋势,发病率达5%(罗马Ⅳ标准)[3].临床上以腹泻型IBS(diarrheatype irritable bowel syndrome,IBS-D)最为常见.该病目前药物治疗效果欠佳,导致患者频繁就诊与检查,严重影响其工作和生活质量,造成极大的心理及经济负担.肠道菌群紊乱与IBS发生密切相关[4],而饮食可以改变肠道微生物组成及其功能[5].控制饮食目前成为IBS一线治疗方式的候选者.低可发酵的寡糖、双糖、单糖、多元醇(fermentable oligosaccharides,disaccharides,monosaccharides and polyols,FODMAPs)饮食可有效改善IBS患者的临床症状[6].食物成分和微生物群之间的相互作用可为IBS病理生理学提供机制上的新见解.本研究前期已经发现苯丙氨酸(phenylalanine,PHE)为IBS模型组小鼠与正常对照组小鼠之间的关键代谢通路[7].PHE可通过钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)刺激胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)释放[8],而GLP-1是一种与饱腹感相关的肠肽激素,具有抗炎活性[9].2021-01/2021-06,我们采用低FODMAPs饮食对IBS-D患者进行干预,观察其临床症状的变化,并对其作用机制进行了初步研究.现报道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料:(1)基本情况:2021-01/2021-06选择在我院消化内科门诊就诊,符合罗马Ⅳ标准[1]的IBS-D患者,共30例.同时征集30名健康志愿者作基线检测对照.本研究通过浙江中医药大学附属杭州市中医院临床研究伦理委员会审核(伦理研究批件号:2020LH004),并与研究对象签署知情同意书.(2)纳入标准:①符合腹泻型IBS罗马Ⅳ诊断标准(处于症状发作期);②年龄20-70岁;③无器质性疾病和生化异常的证据,如甲状腺功能、血沉、肿瘤标志物、粪便常规、腹部B超、内镜等相关检查均无异常发现;④与医生沟通良好,签署知情同意书者.(3)排除标准:①妊娠或哺乳期妇女;②因器质性疾病出现腹痛、腹泻者;③有腹部手术者;④存在严重精神疾病及心、脑、肝、肾等系统并发症的患者;⑤药物滥用或酗酒者;⑥有特殊饮食者;⑦测试期间出现食物过敏史者;⑧实验前4周内曾使用益生菌、抗生素或含有类似成分的中药等影响本研究的药物.(4)中止和脱落标准:①无法坚持治疗的受试者;②研究对象未能实施治疗方案;③出现严重不良反应,不宜继续进行低FODMAPs饮食者;④在治疗过程中病情恶化;⑤未能按研究计划完成回访者被认为是脱落.

1.1.2 体外实验材料:采用NCI-H716细胞,购自中国科学院上海分院.PHE(P5482-10MG)购于Sigma-Aldrich公司.

1.2 方法

1.2.1 干预方法:由一名营养科医生和一名研究方向为IBS的消化内科医生组成饮食指导小组,指导受试者饮食.由饮食指导小组向该组患者发放FODMAPs饮食列表,并采用一对一指导结合集体宣教的方式对该组患者进行饮食指导.要求所有受试者的饮食严格遵循低FODMAPs饮食列表目录[10].并且要确保五类食物的摄入:奶、肉类、水果、蔬菜和豆类.干预时间为4周.饮食干预期间无相关药物治疗.

1.2.2 体外细胞实验:NCI-H716 细胞为肠道L细胞系,来源于人低分化盲肠腺癌,具有内分泌特性,可分泌GLP-1.将NCI-H716细胞用含5%胎牛血清和RPMI 1640培养基复苏后,接种于25 CM2培养瓶,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养.取生长状态良好的细胞,待细胞达90%时接种于六孔板,每孔达到1×105个细胞的接种量.将PHE溶于1 mol/L盐酸中配制成200 mmol/L的母液,并用完全培养液配制成相应浓度的工作液.实验分组如下:①空白对照组;②低剂量PHE组:0.25 mmol/L PHE;③中剂量PHE组:0.5 mmol/L PHE;④高剂量PHE组:1.0 mmol/L PHE.预处理24 h.设两组复孔,每组三次重复.

1.3 观察指标

1.3.1 临床症状评分:对健康对照组及饮食干预组患者治疗前,及4周治疗结束后临床症状进行评分:(1)IBS症状严重程度量表(IBS symptom severity scale,IBS-SSS):IBS-SSS量表总分为500分,每个条目的分值范围为0-100分.总分低于75分为缓解期,轻度、中度及重度的界值分别为75-175,175-300,300分以上[10];(2)粪便性状:采用Bristol评分[11],l-7型分别对应l-7分;(3)排便频率[12]:分为6级:≤2次/wk,3次/wk,1次/d,2 次/d,3次/d,＞3次/d,分别对应l-6分.

1.3.2 血清检测指标:分别于清晨空腹采集健康志愿者,及治疗前、4周治疗结束后IBS患者静脉血8-10 mL,3000 r/min离心15 min,提取血清.标本置于-80 ℃冰箱保存待测.采用ELISA法测定血清PHE,GLP-1,TNF-α,IFN-γ.试剂盒由上海泛柯实业有限公司提供,操作严格按试剂盒说明进行.

1.3.3 细胞上清液检测指标:细胞实验结束后提取各组细胞上清液,置于-80 ℃冰箱保存待测.采用ELISA法测定细胞上清液GLP-1.试剂盒由上海泛柯实业有限公司提供,操作严格按试剂盒说明进行.

统计学处理采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0统计学软件进行统计学分析.对正态分布的计量资料进行t检验,非正态分布变量及计数资料进行秩和检验或χ2检验.以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 基本情况 入组者无一例出现不良反应,均未发生脱落和剔除病例.入组IBS患者平均病程为16.90 mo±0.97 mo.各组人群基本资料中性别、年龄、身体质量指数(body mass index,BMI)方面,差异均无统计学意义,具有可比性.结果见表1.

表1 正常组及IBS组患者性别、年龄及BMI指数

2.2 临床症状评分 与正常组相比,治疗前IBS组患者IBSSSS评分,Bristol评分,排便频率评分均升高,差异具有统计学意义(P＜0.0001 &P＜0.001);治疗后患者IBS-SSS评分,Bristol评分,排便频率评分均较治疗前下降,差异具有统计学意义(P＜0.0001 &P＜0.001).表2,3.

表2 正常组及IBS组患者治疗前后IBS-SSS评分(n=30,mean±SD)

2.3 血清PHE,GLP-1及促炎细胞因子测定 与正常组比较,治疗前IBS组患者血清PHE和GLP-1浓度下降,TNF-α,IFN-γ浓度升高,差异具有统计学意义(P＜0.0001);经治疗后,IBS组PHE和GLP-1浓度较前上升,差异具有统计学意义(P＜0.05),TNF-α和IFN-γ浓度较前下降,差异具有统计学意义(P＜0.0001 &P＜0.001),表4.

表4 正常组及IBS组患者治疗前后PHE、GLP-1、促炎细胞因子浓度(n=30,mean±SD)

表3 正常组及IBS组患者治疗前后Bristol评分及排便频率评分[n=30,中位数(25%,75%)]

2.4 PHE干预对细胞分泌GLP-1的影响 将不同浓度(0.25 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L)PHE加入NCI-H716细胞进行干预后发现,随着PHE浓度增加,GLP-1表达水平逐步上升,1 mmol/L PHE可以显著促进GLP-1分泌,差异具有统计学意义(P＜0.05),表5.

表5 PHE干预对细胞分泌GLP-1的影响(mean±SD)

3 讨论

IBS发病机制复杂.肠道微生物参与IBS发生的病理生理过程[13].肠道菌群失衡可能通过细菌作用后所产生的代谢产物影响神经递质、激素、免疫分子的平衡,进而导致肠道功能紊乱.Zhang等[14]发现IBS患者腹痛和内脏超敏反应,与肠道菌群粪便代谢产物异戊酸,戊酸和异己酸相关.本研究结果表明,与健康志愿者相比,IBS患者血清PHE降低,提示IBS肠道菌群代谢产物发生改变.

PHE对GLP-1释放有促进作用.GLP-1由末端空肠、回肠和结肠的朗罕氏细胞所分泌.研究发现,进食15-180分钟内,多达60%的IBS患者会出现症状发作或恶化,提示与饱腹感相关的激素可能在IBS病理生理过程中起一定作用[15].GLP-1与肠道炎症反应存在密切关系.Kissow等[16]研究发现GLP-1可显著降低化疗后小鼠的肠道粘膜炎症程度评分.二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DP)抑制剂(抑制GLP-1灭活)可以改善结肠炎模型小鼠的结肠炎症,引起促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ分泌减少,以及抗炎细胞因子TGF-β分泌增加[17].本课题研究发现,与健康志愿者相比,IBS患者血清中GLP-1分泌下降,TNF-α和IFN-γ分泌增加.体外实验发现随着PHE浓度的逐渐增加,GLP-1表达水平逐步上升,高浓度的PHE可以显著促进GLP-1分泌.因此,推测PHE通过介导GLP-1调控促炎细胞因子分泌,参与IBS-D的病理生理过程.

IBS作为一种胃肠道疾病,与饮食关系密切.低FODMAPs饮食可有效改善50%-80%IBS患者症状,尤其是腹胀腹泻等症状[18].Varjú等[19]进行荟萃分析,表明与传统的IBS饮食相比,保持低FODMAPs饮食的IBS患者的总体症状评分得到改善,显示出其优于常规IBS饮食治疗的优势.本研究发现,患者经低FODMAPs饮食治疗后,其IBS-SSS评分,排便频率及粪便性状明显改善,提示低FODMAPs饮食有助于改善IBS-D患者临床症状.

饮食中可酵解短链碳水化合物的摄入可诱发或显著加剧IBS症状[20].饮食因素可以影响肠道菌群结构.研究发现用高FODMAPs饮食喂养大鼠,其粪便革兰氏阴性细菌和血清脂多糖含量增加,并伴有肠道炎症,屏障功能障碍和内脏超敏反应增加[21].Mcintosh等[22]发现,低FODMAPs饮食增加了肠道放线菌的丰富度和多样性.杨斌等[23]研究发现低FODMAPs饮食治疗28天,患者大肠杆菌数量较前减少,提示低FODMAPs饮食有调节肠道菌群及其比例的作用.张亮等[24]研究发现IBS大鼠存在肠道菌群失调和部分氨基酸代谢异常,与IBS疾病的发生发展相关.肠道菌群C.sporogenes、Clostridium botulinum与PHE代谢相关[25].李佳琪等[26]对肠道菌群和关键代谢途径中的代谢物进行Pearson 相关分析发现,Christensenellaceae菌科与PHE呈正相关(相关系数大于0.7).因此我们推测经饮食调节后,宿主肠道菌群发生改变,进而影响菌群代谢产物发生改变.在本实验中,行低FODMAPs饮食治疗后,患者血清PHE水平较治疗前升高,同时血清GLP-1亦升高,TNF-α和IFN-γ分泌下降,提示饮食治疗可能通过影响PHE的含量,进而调控GLP-1分泌,抑制促炎细胞因子的产生.

4 结论

综上所述,低FODMAPs饮食对IBS-D患者具有一定的治疗效果.该治疗方法易于被患者掌握,对于存在药物禁忌症的患者或不愿意接受药物治疗的患者而言,无疑是一种较佳选择.因本研究周期较短,样本量较小,故低FODMAPs饮食的远期疗效,及其是否导致机体营养状况下降等不良后果,需在将来行多中心,大样本,长期随访的临床试验来明确.此外,肠道菌群与PHE之间的具体调控机制,将在今后开展动物实验及细胞实验明确.

文章亮点

实验背景

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常见的功能性胃肠道疾病之一.肠道菌群代谢产物苯丙氨酸(phenylalanine,PHE)与IBS发病相关.PHE可刺激与饱腹感相关的肠肽激素胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)释放.低可发酵的寡糖、双糖、单糖、多元醇(fermentable oligosaccharides,disaccharides,monosaccharides and polyols,FODMAPs)饮食是目前新兴的IBS治疗方法之一.

实验动机

关于低FODMAPs饮食是否影响通过肠道菌群代谢产物PHE的产生进而在IBS治疗上发挥作用的研究报道较少.本实验结果有助于为该饮食治疗提供实验室依据.

实验目标

阐明低FODMAPs饮食通过肠道菌群代谢产物PHE调控GLP-1在IBS患者治疗中的分子机制.为该饮食治疗的推广提供理论基础.

实验方法

以本院消化内科门诊腹泻型IBS患者为研究对象,通过对干预前后患者临床症状的调查,阐明低FODMAPs饮食的治疗效果;运用ELISA法检测患者血清PHE、GLP-1,阐明饮食干预前后PHE及GLP-1的变化;运用ELISA法检测患者血清TNF-α,IFN-γ,阐明饮食干预前后机体促炎细胞因子的变化.同时行体外实验,明确PHE对GLP-1分泌的促进作用.

实验结果

经低FODMAPs饮食干预后,IBS患者临床症状得到改善,血清PHE和GLP-1浓度较干预前上升,促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ浓度较干预前下降.体外实验发现,高浓度PHE可以显著促进GLP-1分泌.

实验结论

本实验阐明了腹泻型IBS疾病过程中,宿主肠道菌群代谢产物PHE生成异常,导致不能有效促进GLP-1释放进而引发炎症反应;阐明了低FODMAPs饮食可通过影响PHE刺激GLP-1分泌进而抑制炎症反应.明确饮食-肠道菌群代谢产物-内分泌激素之间存在交互作用.

展望前景

未来需行多中心,大样本,长期随访的临床试验来明确低FODMAPs饮食远期疗效,及其是否导致机体营养状况下降等不良后果.此外,肠道菌群与肠道菌群代谢产物之间的具体调控机制,将在今后开展动物实验及细胞实验明确.