基于网络药理学和分子对接技术探讨复方当归注射液治疗缺血性中风的作用机制

张巧慧，李志勇，刘振权，代雅洁，江 洋，廖 艳，汤轶波

药物重定位具有研发成本低、研发风险低、研发周期短和研发效益高的特点，通过4R原则[重新定位(reposition)、重定用途(repurpose)、重新评价(reprofile)、重定治疗方向(redirecting)]发现，已批准上市药物新的临床适应证或新的用途是药物研发受益/风险比率最高的策略之一[1]。基于临床表型的研究方法建立药物靶点和疾病靶点的网络图，可发现药物新的临床适应证[1]。基于临床表型的药物重定位理论与中医学的异病同治理论基本一致，即不同的疾病若具有相同的临床表型或辨证分型可以采用相同的药物治疗。缺血性中风(ischemic stroke，IS)具有较高的发病率、致残率和死亡率。IS属于中医学“中风”范畴，风、火、痰、虚、气、血等相互作用致病，基本病理机制为瘀血阻络，治宜活血、通络、祛瘀[2]。复方当归注射液(Compound Angelica Injection，CAI)是由当归、川芎、红花3味药组成，临床适应证为痛经(dysmenorrhea)、经闭(amenorrhea)、跌扑损伤(fall injury)和风湿痹痛(rheumatic arthralgia)等血瘀性病症[3]。从中医学辨证分型角度分析，复方当归注射液可治疗辨证瘀血阻络证型IS。在中国知网以“当归”和“中风”为关键词检索得到472篇文献，同理得到川芎301篇文献，红花200篇文献。表明复方当归注射液及其组成药物对治疗IS具有潜在的临床价值，但复方当归注射液干预IS的潜在价值及作用机制尚不明确。网络药理学是应用组学、网络可视化发展而来的系统生物学方法，从整体上揭示疾病、药物、靶点、通路之间的关系，理解和应用中药药理作用机制方面具有重要的意义[4-5]。本研究从临床表型的药物重定位，应用网络药理学方法和分子对接技术，探讨复方当归注射液防治IS的潜在作用，并初步探讨复方当归注射液治疗IS的作用机制。

1 资料与方法

1.1 获取复方当归注射液适应证与IS的靶点 利用基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https://www.omim.org/)、中医药整合药理学研究平台(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP，https://www.tcmip.cn/)V2.0数据库，以“dysmenorrhea”“amenorrhea”“fall injury”“rheumatic arthralgia”为关键词进行检索，合并所得靶点，获取复方当归注射液适应证相关靶点；同理，以“ischemic stroke”为关键词进行检索，获得IS相关靶点。

1.2 复方当归注射液适应证和IS临床表型富集分析 利用FunRich 3.1.3软件[6]对复方当归注射液适应证和IS潜在作用靶点分别进行临床表型的富集分析，并利用FunRich软件比较两者临床表型差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 复方当归注射液成分的获取与靶点的预测 查阅文献获得复方当归注射液发挥作用的活性成分，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取药物活性成分的Canonical SMILES格式，再将化合物的SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction分析平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)，设置属性为“Homo sapiens”，将所得的靶点作为化合物发挥药效的潜在作用靶点，合并所有化合物潜在作用靶点，去除重复靶点，作为复方当归注射液的潜在作用靶点。

1.4 复方当归注射液调节IS潜在靶点的获取 使用FunRich3.1.3软件构建复方当归注射液主要成分潜在作用靶点与IS疾病靶点的交集韦恩图，其交集靶点作为复方当归注射液调控IS的靶点。利用String(https://string-db.org/)数据库，设置属性为“Homo sapiens”，构建交集靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，应用Cytoscape 3.8.0软件MCODE模块分析功能获取复方当归注射液与IS的关键交集靶点，将关键模块的靶点作为复方当归注射液调节IS的潜在作用靶点。

1.5 基因本体(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 使用Metascape(https://metascape.org/)数据库对复方当归注射液调节IS的潜在作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，设置P<0.01，属性为“Homo sapiens”。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台绘制GO和KEGG富集分析气泡图。将成分-靶点-通路导入Cytoscape软件，构建复方当归注射液与IS的“成分-靶点-通路”网络图。

1.6 关键靶点与复方当归注射液成分的分子对接 选取“成分-靶点-通路”网络中连接度(degree)大于中位数的靶点，反向寻找这些靶点对应的复方当归注射液活性成分，利用AutoDock进行分子对接，验证关键靶点与活性成分之间的结合效能。具体方法：①在PubChem检索获取复方当归注射液活性成分的SDF结构文件，并利用Open Babel 2.3.2软件将SDF文件转化为PDB格式文件。②从Protein Data Bank数据库中检索并获得关键蛋白的PDBID编号，利用PYMOL 2.3.4软件对受体蛋白进行去水、去配体等；利用AutoDock tools软件对受体蛋白进行加氢、平衡电荷等修饰。利用Grid Box命令打开Grid Option工具对每个受体蛋白进行处理。调整配体口袋，设置蛋白格点间距为1，设置口袋中心为结合位点中心，并将受体蛋白和配体小分子分别转化为pdbqt格式。③利用AutoDock Vina 1.1.2对受体蛋白与配体小分子分别进行分子对接、结合能(affinity)打分及对接参数。结合能越低提示受体-配体复合物结合效能越好[7]。④选取与配体分子结合效能最佳的靶点绘制分子对接模拟图，采用PyMOL 2.3.4软件制作三维图显示关键靶点与复方当归注射液成分之间的相互作用可视化图。

2 结 果

2.1 复方当归注射液适应证与IS相关靶点 检索GeneCards、OMIM、TCMIP获得痛经、经闭、跌扑损伤和风湿痹痛靶点，合并后分别得到301个、1514个、4 025个、733个靶点，合并复方当归注射液适应证所有靶点，去除重复靶点得到5 015个靶点，同理得到IS共3 416个相关靶点。详见图1。

图1 复方当归注射液临床适应证与IS相关靶点的韦恩图

2.2 复方当归注射液适应证与IS潜在靶点临床表型 FunRich临床表型富集分析结果显示，复方当归注射液可调节神经功能(neurologic)异常、中枢神经系统(central nervous system)异常、周围神经系统(peripheral nervous system)异常、常染色体显性遗传(autosomal dominant)异常、内分泌变化(endocrine features)异常、实验室指标异常(laboratory abnormalities)及其他异常临床表现(P<0.05)，详见图2A。IS临床表型异常表现为常染色体显性遗传异常和血管(vascular)病变(P<0.05)，详见图2B。FunRich软件分析比较复方当归注射液适应证与IS的临床表型结果显示，以IS临床表型为参照，复方当归注射液临床适应证相关靶点与IS靶点存在明显的临床表型交集，主要表现在神经系统异常临床表型，包括神经功能异常和中枢神经系统功能异常(P<0.05)，详见图2C。

图2 复方当归注射液临床适应证和IS临床表型富集分析图(A为复方当归注射液临床适应证临床表型；B为IS临床表型；C为复方当归注射液临床适应证和IS临床表型)

2.3 复方当归注射液潜在靶点的获取及其治疗IS的潜在靶点 查阅文献得到复方当归注射液的活性成分为阿魏酸、新绿原酸、羟基红花黄色素A、隐绿原酸、绿原酸和咖啡酸[8]，在Swiss Target Prediction平台获得这些活性成分潜在靶点共260个，详见表1。在FunRich软件中获得复方当归注射液成分靶点与IS疾病靶点交集靶点共165个，导入String平台获得PPI图，在Cytoscape 3.8.0软件模块分析获得一个主要模块，该模块共27个靶点，含有27个节点、299条边，score为23 000，认为这27个靶点为复方当归注射液治疗IS的潜在作用靶点，详见图3。

表1 复方当归注射液活性成分及其潜在靶点

(续表)

图3 复方当归注射液靶点预测与IS相关基因的韦恩图与交集靶点的PPI网络

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 GO功能富集结果显示，复方当归注射液治疗IS与387个生物过程(biological process，BP)、51个分子功能(molecular function，MF)和42个细胞组成(cellular component，CC)具有相关性(P<0.01)，分别选取-LogP值居前10位绘制GO富集分析条形图(其中CC有9条)，详见图4。KEGG通路富集分析结果包括125条信号通路(P<0.01)，选取与IS疾病相关的20条信号通路[9-15]并绘制气泡图[16]，详见图5。通路分别为：糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路[advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products(AGE-RAGE)signaling pathway in diabetic complications]、肿瘤坏死因子信号通路[tumor necrosis factor(TNF)signaling pathway]、流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素17信号通路[interleukin-17 (IL-17)signaling pathway]、缺氧诱导因子1信号通路[hypoxia inducible factor-1(HIF-1)signaling pathway]、磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路[phosphatidylinositol 3 kinase-serine-threonine protein kinase(PI3K-Akt)signaling pathway]、凋亡(apoptosis)、有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路[mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathway]、Toll样受体信号通路(Toll-likereceptor signaling pathway)、坏死病(necroptosis)、两面激酶-信号转导和转录激活因子信号通路[janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT)signaling pathway]、核转录因子κB信号通路[nuclear factor-κB-gene binding(NF-κB)signaling pathway]、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)、自噬-动物(autophagy-animal)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、白细胞跨内皮迁移(leukocyte transendothelial migration)、紧密连接(tight junction)、Th1和Th2细胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity)、趋化因子信号通路(chemokine signaling pathway)。将信号通路中的靶点回溯到复方当归注射液适应证与IS的差异性临床表型中，结果显示复方当归注射液防治IS与中枢神经功能异常的临床表型有关，且复方当归注射液主要通过调控抗凋亡信号通路、抗炎症反应信号通路和保护血脑屏障相关信号通路发挥防治IS的作用。详见表2。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG通路富集分析

表2 复方当归注射液治疗IS相关通路及其映射到交集临床表型的靶点

2.5 复方当归注射液治疗IS的多维网络分析 将复方当归注射液的活性成分及其治疗IS的潜在靶点、通路导入Cytoscape软件中构建“成分-靶点-通路”网络图，结果显示，复方当归注射液的6个活性成分参与并调控IS疾病发展的多个靶点和多条信号通路。详见图6。显效理论即多个成分在不同的靶点中存在时间和空间的药效叠加作用，且不同靶点之间存在相互协同作用[17]，这是中药发挥药效药理作用的重要机制。

图6 复方当归注射液治疗IS的“成分-靶点-通路”网络(外圈圆形为靶点，颜色越深，面积越大，度值越大；中间绿色六边形为信号通路；内圈粉紫色椭圆形为成分；TL为信号通路，CF为复方当归注射液活性成分，羟A为羟基红花黄色素A)

2.6 关键靶点分子对接 选取“成分-靶点-通路”网络中度值>中位数(degree>23)的12个靶点，并反向映射这些靶点对应的复方当归注射液活性成分进行分子对接，详见表3。结合能<-29.29 kJ/mol提示具有较好的结合效能，对接效能与结合能呈负相关性。结果显示，阿魏酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸与基质金属蛋白酶9(MMP9)的结合效能最佳，羟基红花黄色素A与MTOR的结合效能最佳，绿原酸与有丝分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)的结合效能最佳，根据结合能绘制对接模式图，模拟图左边为分析对接的整体效能图，右边为分子对接放大的位点图。详见图7。

表3 关键靶点与其映射化合物的结合能

图7 关键靶点与最低结合能成分的分子对接模拟图(A为MAPK8与绿原酸；B为MMP9与隐绿原酸；C为MMP9与新绿原酸；D为MMP9与咖啡酸；E为MMP9与阿魏酸；F为MTOR与羟基红花黄色素A)

3 讨 论

异病同治是中医学辨证论治的体现，《黄帝内经》《伤寒杂病论》等经典著作中充分包含辨证施治的内涵，清代陈士铎《石室秘录》记载：“同经者，同是一方，而同治数病也。”正式提出异病同治的概念[18]。异病同治内涵是指不同的疾病若促使疾病的病理机制相同，可采用同一种方法治疗。后世医家以经方、名方“异病同治”多种疾病收获不俗的效能。贾六金教授应用参苓白术散治疗脾虚泄泻、脾虚厌食、脾虚便血和脾虚闭经等[19]；刘友章教授应用甘露消毒丹治疗痛风、湿疹和慢性乙肝[20]；赵德喜教授应用小柴胡汤治疗头痛、失眠、郁病等[21]。在异病同治理论的指导下，充分体现中医药治疗疾病的灵活性与多效性。近年来，兴起药物重定位的概念，利用系统生物学、计算生物学、网络药理学等技术对已上市的“老药”进行重新评估，以期获得“新用途”，不仅极大地降低了药物研发的成本与风险，同时可提高药物研发的效益，已成为药物研发的重点策略之一[1]。

复方当归注射液是广泛应用于治疗临床多种疾病的中成药，其说明书明确写明复方当归注射液临床适应证为痛经、经闭、跌扑损伤和风湿痹痛。痛经、经闭的主要病理机制均包括气滞血瘀[22-23]，跌扑损伤的病理机制为瘀血肿痛[24]，风湿痹痛的病理机制为经络瘀闭[25]。根据异病同治理论可知，复方当归注射液可有效治疗“瘀”滞性疾病。中风居中医学四大难治病之首，是由于气血失调、阴阳失衡加之劳倦内伤、暴饮暴食、嗜食烟酒等造成脏腑阴阳失调，气血逆乱直冲犯脑，引发脑脉痹阻或血溢脑脉的病证[26]。因中风具有起病急、变化快、病情危重等特点，受到了历代医家的广泛研究，从唐宋之前的外风立论，金元时期的内风立论，明清时期的内外风并论，到衷中参西理论的发展，深刻认识中风的发生发展为虚实夹杂、脉络瘀阻，治宜活血通络、祛瘀止痛。本研究基于异病同治及药物重定位理论探讨复方当归注射液防治IS的潜在价值，并通过网络药理学和分子对接技术初步阐明复方当归注射液防治IS的作用机制。

利用FunRich软件进行复方当归注射液临床适应证与IS临床表型的研究。结果显示，复方当归注射液具有治疗IS神经功能异常和中枢神经系统功能异常的作用，认为复方当归注射液具有治疗IS的潜在作用，研究复方当归注射液抗IS具有重要的临床意义。冀宇兰[8]利用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS技术及负离子模式下的色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18质谱信息鉴定出复方当归注射液的6个化合物：阿魏酸、羟基红花黄色素A、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸。在Swiss Target Prediction数据库分别获取复方当归注射液的6个化合物潜在靶点，最终确定复方当归注射液潜在靶点共260个靶点，与IS疾病靶点交集获得165个交集靶点。利用PPI网络最终确定复方当归注射液治疗IS与27个关键靶点有关，包括有丝分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、原癌基因JUN、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、半胱氨酸肽酶(Caspase 3，CASP3)、Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、MMP9等，主要与细胞凋亡、炎症反应等有关。初步认为复方当归注射液具有抗IS的作用，且与抗凋亡和抗炎症反应有关。

本研究对27个关键靶点进行KEGG通路富集分析，结果显示复方当归注射液干预IS与125条信号通路密切相关，选取其中与IS密切相关的信号通路绘制气泡图。结果与先前靶点预测一致，复方当归注射液治疗IS集中在细胞凋亡相关信号通路(TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、凋亡、自噬等通路)、炎症反应相关信号通路(IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、Th1和Th2细胞分化相关通路等)。复方当归注射液干预IS与血脑屏障的完整性有关。血脑屏障是由脑内皮细胞、基底膜、紧密连接蛋白、神经胶质细胞等构成的屏障，可阻止某些分子和物质由血液进入脑组织，并严格调控血管内外的物质交换，是维持脑微环境稳定和发挥正常神经功能的重要器官[27]。中风后，坏死的神经元释放过量的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，激活并释放大量促炎性因子、趋化因子及MMP2/MMP9，破坏了血脑屏障的完整性，导致外周血炎性因子和有害物质浸润中枢，引发二次损伤级联，加重脑梗死发展[12]。通过网络药理学发现，复方当归注射液可干预MMP2、MMP9的释放并激活紧密连接蛋白相关通路，进而发挥保护血脑屏障的作用。通过分析复方当归注射液适应证与IS差异性临床表型进一步证实复方当归注射液可有效防治IS的进展，该机制可能与调控中枢神经系统异常的凋亡反应、炎症反应及血脑屏障的完整性有关。通过构建“成分-靶点-通路”网络图，直观发现复方当归注射液通过多靶点、多通路、多途径发挥干预IS的作用。

为了进一步探讨复方当归注射液抗IS与某一具体的成分和有关靶点，进行了分子对接验证。选取度值>中位数的12个靶点与复方当归注射液的6个核心成分进行分子对接，结果显示复方当归注射液成分与这些关键靶点均结合良好，其中阿魏酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸与MMP9的结合效能最佳，羟基红花黄色素A与MTOR的结合效能最佳，绿原酸与MAPK8的结合效能最佳。因此，复方当归注射液参与IS的调控主要与调节MMP9、MAPK8及MTOR的表达有关。其中MMP9主要与血脑屏障的完整性有关[28]，而MAPK8、MTOR主要参与细胞凋亡[29-30]。由此可知，复方当归注射液通过多种途径发挥干预IS的作用。

综上所述，复方当归注射液可能从抗凋亡、抗炎、保护血脑屏障等方面发挥干预IS的作用，治疗IS具有潜在的优势。复方当归注射液治疗IS值得进一步深入进行药效研究及分子机制实验验证，为拓展复方当归注射液临床适应证的研究提供了方向，同时为老药新用提供了新的挖掘方法。