醋酸杆菌A.pasteurianus SP001冷冻干燥工艺研究

孙一帆，陈思，梁新红，高莹莹

(河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003)

随着人们生活水平的不断提高和对食醋的营养价值和保键功能的充分认识，以及科学研究对果醋功效特性的提示，市场上对果醋的需求量越来越大[1-3]。醋酸杆菌是醋酸发酵工业的主要用菌[4-5]，因醋酸菌具有自灭性、易变异，不易保藏等特点[6]，所以对醋酸杆菌的保藏方法和效果的研究具有重要的现实意义。为了在酿造生产过程中选育到优秀的醋酸菌菌株，选择适宜的保藏方法尤为重要。醋酸杆菌的常规保藏方法为斜面保藏和液体保藏，都需要定期传代[7]。但是醋酸杆菌与其他菌种不同，很容易变异[8]。而定期传代又增加了其退化和变异的概率，这样会使宝贵的醋酸菌菌株得而复失，让今后的研究不能正常进行，甚至可能会给工业生产带来很大的损失和危害[9]。因此，为了保持醋酸菌的优良性状和活力，选择适宜的保藏方法尤为重要[10]。在众多醋酸杆菌的保藏方法中，真空冷冻干燥保藏的方法提供的低温、真空以及干燥的条件，可以使所保藏的菌株活性保存10年以上，且当菌种被应用时，只需要添加水分进行复水活化，具有使用方便、易保藏等特点[11-12]。

真空冷冻干燥方法的基本工艺是先将目标菌株进行高密度培养，在菌株活力和浓度较高时收集菌体，然后将收集到的菌体悬浮在适宜的冷冻保护剂中进行预冻，真空冷冻干燥过程中影响微生物活性的因素很多，其中预冻温度和保护剂种类的影响尤为突出[13-15]。本试验主要研究了保护剂的种类和预冻温度对醋酸杆菌活菌数及产酸量的影响，以期为果醋工业生产提供高活性醋酸菌冻干粉。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

醋酸杆菌：A.pasteurianusSP001, 河南科技学院食品学院分离、鉴定、纯化。

1.1.2 试剂

酵母膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、葡萄糖、无水乙醇、琼脂、K2HPO4、氢氧化钠、海藻糖、磷酸钾缓冲液(分别配制浓度为0.05 mol/L的KH2PO4和0.05 mol/L的K2HPO4溶液，然后将配制好的两种溶液混合，调节pH值范围为5.5～6.0即可)、甘露醇、结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、香柏油、二甲苯。

1.1.3 主要仪器

SW-CJ-ID单人单面垂直送风(经济型)净化工作台 苏州智净净化设备有限公司；WFJ7200分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；FA124电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHP恒温生化培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；XSP-BM-2CA生物显微镜 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；H1850R离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-4LSC冷冻干燥机、摇床 上海通特电讯设备厂；PHS-3C pH计 上海盛磁仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 冷冻干燥前菌种生长曲线的测定

1.2.1.1 液体培养基的配制

酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、pH值自然，于121 ℃灭菌20 min，备用，使用时加入3%的无水乙醇。

1.2.1.2 培养

分别编号1，2，3，4，5，6，7。每个锥形瓶中含液量100 mL，按照无菌操作法向7个锥形瓶中分别加入3%的无水乙醇和10%的果醋。接种后的锥形瓶置于摇床上，在30 ℃、100 r/min的条件下振荡培养，其中1号置于冰箱中作为对照。

1.2.1.3 测定

每隔3 h于波长610 nm处用分光光度计测定上述细菌菌悬液的吸光值。

1.2.1.4 绘制曲线

以细菌菌悬液的吸光值为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制其生长曲线。

1.2.2 菌悬液的制备

取3瓶装有液体培养基的锥形瓶，每个锥形瓶中含液量100 mL，按照无菌操作法向3个锥形瓶中分别加入3%的无水乙醇和10%的葡萄醋。接种后的锥形瓶置于摇床上，在30 ℃、100 r/min的条件下振荡培养，培养至菌密度最大，于4 ℃保存，用于冷冻干燥。

1.2.3 冷冻干燥

将菌密度达到最大时的菌悬液在9600 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，倒去上清液，沉淀物用磷酸钾缓冲液溶解后在上述条件下再次离心，除去上清液后沉淀物用保护剂溶解，然后倒入培养皿中，每个培养皿中的液体厚度不能超过2 mm。将上述分装好的培养皿口用保鲜膜封好，置于不同的温度条件下预冻12 h，然后用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥。

1.3 分析方法

1.3.1 活菌计数

液体培养基的配制：酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、琼脂2%、pH值自然，于121 ℃灭菌20 min，备用，使用时加入3%的无水乙醇。在无菌工作台上，将冻干后的菌种用无菌水溶解，用移液枪吸取0.3 mL的稀释液于平板上，然后置于30 ℃的恒温箱中培养3～4 d后进行活菌计数。

1.3.2 醋酸含量的测定

以标定后的氢氧化钠溶液(浓度接近0.1 mol/L)滴定发酵液，指示剂为酚酞试剂，结果以醋酸(g/dL)计。为了保证测定结果的准确性，每次测定进行统一操作，步骤：1 mL发酵液→加入9 mL蒸馏水→加2滴酚酞→滴定记录。

1.3.3 产酸曲线的测定

将干燥后的菌种用无菌水溶解，接种于产酸培养基中，测定其产酸量，以时间为横坐标、产酸量(g/dL)为纵坐标绘制曲线，并与冷冻干燥前菌株的产酸量进行对比。

1.3.4 冻干前后酒精转化率的计算

将冻干前后的菌株接入液体培养基中，测定其最大产酸量，进而计算其酒精转化率。

转化率(%)=产酸量(g/L)/发酵液酒精含量(g/L)/1.304。

产酸量(g/L)=最大产酸量(g/L)-培养基含酸量(g/L)-接入菌种的含酸量(g/L)。

1.3.5 冷冻干燥前后菌株在葡萄酒中的发酵效果的比较

分别将冷冻干燥前后的菌株接入液体培养基中，在30 ℃、100 r/min 的摇床中培养3～4 d，使菌株活化，然后按照10%的接种量分别将冷冻干燥前后的菌种接入葡萄酒中，测定其产酸量，从而对真空冷冻干燥前后的菌株在葡萄酒中的发酵效果及发酵周期进行比较。

1.4 统计分析方法

采用DPS 7.55数据处理软件对试验数据的方差显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 冷冻干燥前醋酸杆菌SP001生长曲线的测定

按照1.2.1所述生长曲线的测定方法，分别将编号1，2，3，4，5，6，7的每个锥形瓶中装入液体培养基100 mL，按照无菌操作法向7个锥形瓶中分别加入3%的无水乙醇和10%的米醋。接种后的锥形瓶置于摇床上，在30 ℃、100 r/min的条件下振荡培养，其中1号置于冰箱中作为对照。然后每隔3 h于波长610 nm处用分光光度计测定细菌菌悬液的吸光值。以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制曲线，结果见图1。

图1 冷冻干燥前A. pasteurianus SP001的生长曲线Fig.1 The growth curve of A. pasteurianus SP001 before freeze drying

由图1可知，0～10 h为A.pasteurianusSP001的延滞期，12～36 h为A.pasteurianusSP001的对数生长期，36～66 h为稳定期，66 h后，菌体生长速率小于其死亡速率，进入衰亡期。因此，用于真空冷冻干燥的菌体应为培养到36 h的菌体，以使冷冻干燥后获得较多的菌体。

2.2 预冻温度对冷冻干燥后菌种活性的影响

依据1.2.3和1.3.1的方法，对预冻后的菌体进行活菌计数，结果见图2。

图2 预冻温度对冷冻干燥后菌株活性的影响Fig.2 Effect of pre-freezing temperature on the activity of bacteria after freeze drying

由图2可知，预冻温度为-30 ℃时，当保护剂为10%的葡萄糖+2%的海藻糖时，其活菌数为(450±21) CFU/mL，当保护剂为10%的甘露醇时，其活菌数为(260±12) CFU/mL。而当预冻温度为-60 ℃时，两种保护剂的活菌数分别为(680±23) CFU/mL和(500±19) CFU/mL。当预冻温度为-90 ℃时，两种保护剂的活菌数分别为(520±16) CFU/mL和(310±12) CFU/mL。-60 ℃预冻的效果比-30 ℃预冻的效果较好，这可能是因为菌悬液在-30 ℃预冻时，其温度已降至冰点以下，但结冰不够坚实，真空干燥时易使菌悬液沸腾，菌体细胞受损失较多。而在-60 ℃预冻时，结冰速度快且坚实，细胞损伤较少。因此，-60 ℃的预冻温度最好。

2.3 保护剂种类对冷冻干燥后菌株活性的影响

2.3.1 不同保护剂对冷冻干燥后状态的影响

按照1.2.3所述的方法进行真空冷冻干燥，经过冷冻干燥后，菌体与保护剂的混合物失去水分而成干燥状态，结果见图3和图4。

图3 10%的葡萄糖+2%的海藻糖

图4 10%的甘露醇

由图3和图4可知，保护剂为10%的葡萄糖+2%的海藻糖时，冷冻干燥后培养皿中的糖分残余物较少，而当保护剂为10%的甘露醇时，培养皿中的固体残余物较多，冷冻干燥后除去水分，使甘露醇过饱和而析出，与溶解前的状态无太大差异，因此从这方面来看，以10%的葡萄糖+2%的海藻糖为保护剂的冷冻干燥效果比较好。

2.3.2 不同保护剂对冷冻干燥后菌种活性的影响

按照1.2.3和1.3.1的方法，对不同保护剂对冷却干燥后菌株活性进行研究，结果见图5。

图5 不同保护剂对冷冻干燥后菌株活性的影响Fig.5 Effects of different protective agents on the activity of bacteria after freeze drying

由图5可知，在-60 ℃的预冻温度下，以10%的葡萄糖+2%的海藻糖为保护剂时，活菌数为(680±23) CFU/mL，而当以10%的甘露醇为保护剂时，活菌数为(500±19) CFU/mL。两者相差180 CFU/mL，因此，由上述结果可知以10%葡萄糖+2%的海藻糖为保护剂的细胞存活数较高，而以10%的甘露醇为保护剂的细胞存活数较低。因此，选择10%的葡萄糖+2%的海藻糖作为A.pasteurianusSP001的冻干保护剂。

2.4 冷冻干燥干燥前后菌种产酸曲线的比较

按照1.2.1和1.3.2的方法，将干燥前后的菌种分别接种在液体培养基中，测定其产酸量(g/dL)，结果见图6。

图6 冷冻干燥前后菌种的产酸量比较Fig.6 Comparison of acid production of bacteria before and after freeze drying

由图6可知，随着发酵时间的进行，冷冻干燥前后的菌种在发酵过程中产酸量都有所增加，真空冷冻干燥前的A.pasteurianusSP001在第7天时产酸量达到了最大值，即(2.86±0.08) g/dL，而冷冻干燥后的菌种在第9天的达到最大产酸量(2.63±0.07) g/dL，两者的最大值相差0.23 g/dL，相差量为8.1%，但是，在醋酸发酵的第3天到第5天，冷冻干燥前后产酸量明显不同，冷冻干燥后菌种延滞期延长，因此，要获得较高产酸量，冷冻干燥后A.pasteurianusSP001发酵时间最佳为9 d。

2.5 冻干前后乙醇转化率的比较

依照1.3.3的方法，将冻干前后的菌种接入培养基中，测定其最大产酸量，计算其酒精转化率，结果见表1。

表1 冷冻干燥前后菌种的酒精转化率Table 1 The ethanol conversion rate before and after freeze drying

由表1可知，真空冷冻干燥前菌种的酒精转化率为73.00%，冷冻干燥后菌种的酒精转化率为67.67%，表明冷冻干燥对菌株与未冻干菌株的活性有差异显著性，其差值为5.33%。

2.6 冷冻干燥前后菌种在葡萄酒中发酵效果

按照1.3.5的方法，分别将冷冻干燥前后的菌种接入葡萄酒中，将葡萄酒发酵转化为葡萄醋，在发酵过程中，测定其产酸量(g/dL)，分析冷冻干燥前后菌种的活性以及发酵周期的差别，结果见图7。

图7 冷冻干燥对A. pasteurianus SP001在葡萄酒中发酵的影响Fig.7 Effect of freeze drying on the fermentation of A. pasteurianus SP001 in wine

由图7可知，真空冷冻干燥前，菌种在葡萄酒中发酵，在第10天就达到最大产酸量(6.06±0.14) g/dL，而冷冻干燥后的菌种在第13天时达到最大产酸量(5.85±0.15) g/dL，并趋于稳定。冷冻干燥前后最大产酸量相差0.21 g/dL，其相差量为3.5%，但是冷冻干燥后的发酵周期却延长1 d。

3 结论

以A.pasteurianusSP001为研究对象，通过对真空冷冻干燥过程中预冻温度和保护剂种类的研究，采用10%葡萄糖+2%海藻糖制成的醋酸菌保护剂，经-60 ℃的预冻所制成的冻干菌的保藏效果良好。A.pasteurianusSP001培养36 h后进行冷冻干燥，冻干粉在乙醇含量为3%(V/V)培养基中培养9 d时醋酸产量最大，产值为(2.63±0.07) g/dL，在乙醇含量为6%(V/V)葡萄酒中发酵第13天醋酸产量最大，产值为(5.85±0.15) g/dL。真空冷冻干燥后菌种活性较好，能够进行果醋酿造的工业应用。A.pasteurianusSP001冻干粉发酵时间相对新鲜菌种较长，其原因及机理还需进一步研究。随着果醋酿造技术的发展以及真空冷冻干燥微生物技术的日益完善，真空冷冻干燥醋酸菌粉必将为果醋行业提供巨大的发展空间，也将为我国食品行业的发展做出很大的贡献，相信在未来会有更完善的技术和设备在这方面加以应用。